western blot
1、清洗板子，兩塊大膠（1.0 mm）,兩塊薄板。用紗布倒少許洗潔精至海綿面，來回仔細搓洗，特別是大板兩邊凹/凸起部分，然後蒸餾水沖洗，薄板兩邊要仔細清洗。55 ℃烘箱30 min, 拿出後用無塵紙講殘餘液體吸乾。（板子下部邊緣出如果有破損，漏液的可能性比較大）
2、挑選薄板平整面向下，在桌面上來回壓平，放在制膠器橡膠條上，夾緊
3、10%的分離膠配10 mL
按照配方比例。原料有：H2O，30%的Arcylamide (4℃結晶紫瓶子)； 1.5M Tris-Hcl (pH 8.8); 10 SDS; 10% 的過硫酸銨(APS,4℃); TEMED(有毒); 每塊板子各加4~5 mL, 異丙醇或者乙醇液封。凝膠1 h。
4、濃縮膠 2 mL
倒掉乙醇，純水沖洗，不要對準膠衝，3 M濾紙吸乾，梳子用無塵紙吸乾水分高備用，按配方配濃縮膠，加入玻璃板，插上梳子，凝膠1h。
5、準備樣品，樣品pro處理100 ℃，10 min; 已處理好，又凍存的樣品100 ℃
6、配running buffer 1 mL,(100 mL 10× running buffer + 900 mL dH2O)上下顛倒混勻, 將玻璃板取出放在跑膠槽上，薄板朝向兩邊，夾緊，加入running buffer
點樣、70 v ,15 min 110 v 跑1.5~2 h (恆壓)
7、轉膜
- a、轉膜buffer： 10 mL 10× Transfer buffer + 200 mL 甲醇 + 700 mL dH2O
- b、將transfer buffer 倒入， 將夾子、NC膜放入Buffer中，左白右黑。
- c、起膠，先用水衝一下，綠板起薄板，寧可慢一些，也不能把膠弄碎。若膠在大板上，直接正放；若在薄板上，則反着放在buffer中。
- d、 在黑夾子上，一塊黑海綿上加一塊白海綿，再兩層濾紙，加膠，加NC膜，再濾紙，再白海綿，壓板。整個過程趕走氣泡，弄好後，膠在buffer中不能幹。
- e、放入轉移槽中，夾子的黑色面對槽子的黑色面，放冰盒，加Buffer，整個放入盆子中，加冰，110 V, 90 min (恆壓)
- f、轉膜結束後，dH2O 1~2 min, 倒掉水， 加入麗春紅染液，使Pro 顯色 5 min, 回收麗春紅， dH2O 洗滌1~2次。
- g、剪膜，放入盛有dH2O的平皿中，放入搖牀水洗2 次，倒掉， 加入BSA（5 % BSA in PBST）封閉 1 h [大槽3 mL, 小槽 2 mL] (最低轉速)
- h、加一抗 1~2 mL(對應合適濃度)，4 ℃搖牀過夜。（最低轉速）
加入麗春紅染一下，d H2O 加入，趁着有顏色趕緊截膜，在桌子加d H2O, 將膜保持溼潤，一般一個向線內截一張膜。
轉膜時配：PBST (0.1 % Tween) 10 × PBS