信噪比：高端科研級相機的核心參數
如果從成像結果來考察一款科研相機，最重要的一般有3個特徵：
- 黑白還是彩色。彩色相機能帶來顏色信息，但靈敏度和分辨率都不及同參數的黑白相機。
- 幀速。無論是高速移動的樣品還是一閃而過的光信號，都需要高幀速相機纔有可能採集到。
- 成像質量。影響成像質量（或者經常聽到"清晰度"這樣的口頭表述）的因素，包括信噪比和分辨率。無論是信噪比過低，還是分辨率過低，都無法得到讓人滿意的圖片（如圖1）。
圖1. 信噪比和分辨率對成像質量的影響
信噪比公式及解析
在相機的成像過程中，除了真實的信號，還會引入一系列的不確定性（光信號本身的不確定性、材料熱運動，電子學噪聲等等）——稱爲噪聲。而信號與噪聲的比值被定義爲信噪比（Signal-to-Noise Ratio, SNR）。
相機的信噪比可以通過如下公式計算得出：
圖2. 信噪比公式
公式中的分子部分就是"信號"，單位時間的入射光子數目（P，即信號的強度）乘以曝光時間（t），即爲入射光子的總數目，其中有一定比例（QE，量子效率）被相機轉換爲電荷，最終稱爲相機成像的"信號"。
公式中的分母部分是"噪聲"，分成三個組成部分。
- 第一個部分是來自"真實信號"的散粒噪聲：P·QE·t。如何理解這個"散粒噪聲"呢？比如原始的光信號對應每秒鐘100個光子落到一個像素上，但實際的情況卻有可能是第一個一秒鐘，落下了97個光子；第二個一秒鐘落下了104個光子；第三個一秒鐘落下來101個光子；等等等等。這種不確定性就是散粒噪聲的來源。
- 第二個部分是來自暗電流的散粒噪聲：D·t。由於相機的芯片是Si（或者InGaAs等其他材料），只要不是絕對零度，電子的熱運動都會有機率被當成"信號"讀出——稱之爲暗電流。暗電流可以隨着時間而積累。雖然暗電流是可能通過後期算法給扣除的，但是其不確定性，或者說來自於暗電流的散粒噪聲卻無法消除。
- 第三個部分是讀出噪聲：R。讀出噪聲的來源很多，實際操作中，將相機的蓋子關閉（即沒有任何光信號），採用最短的曝光時間（儘可能排除暗電流/暗噪聲的影響）所得到的圖像中的像素值的不確定性就被記爲讀出噪聲。讀出噪聲是一個籠統但是很有實用性的概念——尤其在高速弱光成像中，因爲此時曝光時間很短，所以暗電流/暗噪聲都很小，主要的噪聲來源就是讀出噪聲。
由於以上三種噪聲來源互不相關，所以總噪聲就等於其平方和再取平方根。
對於特定的拍攝條件，讀出噪聲和暗電流都是固定的。所以信號越強，其散粒噪聲也越大，成爲噪聲的主要來源。此時信噪比公式可以近似爲：
圖3. 信號較強時的近似信噪比公式
但如果信號很弱，來自信號的散粒噪聲就很小，此時讀出噪聲和暗電流的影響就不能忽略。
那麼，如果希望提升相機成像的信噪比，改善信號較弱時的成像質量，我們能夠從上面的信噪比公式中得到怎樣的啓發呢？大致說來有6個方面。
影響信噪比的因素1. 曝光時間
無論是從大家日常的理解還是從信噪比公式中，我們都很容易得出曝光時間（t）越長，信噪比越高的結論。
圖4. 曝光時間與信噪比的關係
然而曝光時間長了，幀速就無法得到保障。曝光時間爲1s時，無論如何幀速也是無法超過1幀/秒的。
所以，曝光時間的延長能夠提升信噪比，但是會損失幀速。
影響信噪比的因素2. 光學系統的素質
對於同一樣品發出的信號，光學系統直接影響到落到相機上的光信號強度（即公式中的"P"）。對於顯微成像而言，最常見的提升方式就是選擇更好的物鏡；一般而言，數值孔徑（NA）越大，物鏡對信號的收集能力越強。
圖5. 不同數值孔徑（NA）的物鏡對成像效果的影響。(a) Plan 20×/0.4 NA; (b) UPlanFL N 20×/0.5 NA; (c) UPlanSApo 20×/0.75 NA.（參考用圖，如若侵權請聯繫刪除）
影響信噪比的因素3. 像素尺寸
像素尺寸也是影響信噪比公式中的"P"（入射的光子數目）；像素尺寸越大，落到一個像素上的光子就越多。在其他參數都一致的情況下，信噪比自然就越高。但過大的像素尺寸會損失相機的分辨率（相關討論可參考《相機像素尺寸（像元大小）和成像系統分辨率之間的關係》。
簡而言之，在不調節光路僅僅更換相機的情況下（這是非常常見的場景），採用更大像素尺寸的相機在增加信噪比的同時往往會降低圖像的分辨率（如圖6）。
圖6. 不同像素尺寸相機對同一樣品的成像效果對比。樣品爲直徑1μm的熒光小球，放大倍數60X
影響信噪比的因素4. 製冷與暗電流
由於暗電流（信噪比公式中的"D"）來源於材料中電子的熱運動，所以芯片溫度越高，暗電流越大；對於同一芯片，近似的規律是溫度每下降10度，暗電流減小一半。
當前市場上的中高端科研相機的暗電流通常都很小，在1s以下曝光時間時，暗噪聲相比於讀出噪聲通常可以忽略。但由於暗電流隨曝光時間會積累，所以越是長曝光時間的應用，製冷就越重要。
在實際選型中，不同類型的相機對製冷的要求也不盡相同：
- 對於EMCCD相機，像素尺寸通常較大（常見的爲13-16μm），每個像素上產生的暗電流本就較多，而且EMCCD中的暗電流還會和信號一起被增益放大，所以用製冷壓制EMCCD相機的暗電流產生尤其重要。因爲這些原因，主流的EMCCD相機制冷溫度都在-50℃以下。
- 而對於sCMOS相機，不僅像素尺寸會較小一些（常見的爲6.5μm），也沒有額外的增益，所以對製冷的要求就相對低一點。
從圖7中可以看到，在sCMOS相機中，製冷溫度的具體高低影響不是那麼明顯，但有沒有製冷對暗噪聲的表現影響很大（圖7-A是沒有製冷的相機，圖7-B,C,D都是有製冷的）。這是因爲，一旦沒有製冷，相機的芯片工作溫度並不是簡單的室溫，而通常高達60-70℃，在長時間曝光中（如圖7中的10s曝光時間），其暗電流自然就會高到不可忽視。
筆者在平時工作中，就曾經有過兩個有趣的相關經歷。第一個是剛接觸科研相機時，看到許多諸如室溫下10℃（-10℃ from ambient temperature）的相機，表示不可理解，覺得"就10度的製冷，這有啥用？"。第二個是濱松有一款面向產業客戶的板級sCMOS相機C11440-62U，其製冷溫度爲室溫上10℃（+10℃ from ambient temperature），剛看到參數的時候也是小小疑惑了一把。其實當年產生這樣的疑惑，就是因爲沒有意識到如果相機沒有製冷，實際的工作溫度將遠超室溫這一點。
圖7. 冷卻對相機的影響。四張圖片來自於四臺相機，均採用10s的曝光時間，LUT設置成一樣。這四臺相機採用了同樣的芯片，但製冷溫度不同。從左至右依次爲：(a) 沒有製冷（C11440-52U）；(b) 製冷溫度爲10℃（C11440-42U）；(c) 製冷溫度爲-10℃（C11440-22CU，風冷模式）；(d) 製冷溫度爲-20℃（C11440-22CU，水冷模式）
對於當今的高端相機，只要有製冷，暗電流都很小。
影響信噪比的因素5. 量子效率
量子效率（即信噪比中的QE）爲光子在相機像素上轉換成爲電子的比例。同樣是100個光子落到一個像素上，QE 82%意味着相機能夠轉換得到82個電子；QE 72%則代表能轉換得到72個電子。顯然，QE越高，相機的信噪比越高。
圖8. 量子效率對信噪比的影響
有關QE，看參數時需要特別注意以下兩點：
- QE與波長是有關的，對於同一臺相機，不同波長的QE並不相同。以ORCA-Flash 4.0 V3爲例，在600nm的紅光處其QE爲最高的82%，在900nm的紅外光處就只剩下了25%左右。
- 一般我們在高端科研相機的參數表中看到的都是量子效率峯值——也就是相機最靈敏的波長所對應的QE。但是，不同相機/芯片的量子效率峯值所對應的波長並不一樣，所以如果確切的直到自己信號的波長/顏色，最好能夠確認下相機在對應波長下的QE，而不是簡單地比較量子效率峯值。
如圖9中左圖所示，ORCA-Spark的峯值波長在450-500nm之間，QE峯值爲80%；而Flash 4.0 LT的峯值波長在550-600nm之間，QE峯值爲72%。雖然ORCA-Spark的量子效率峯值更高，但如果針對紅色熒光，Flash 4.0 LT的QE反而更好。
QE很重要，但QE峯值更多是個參考，查到關注波長的QE值非常關鍵。
影響信噪比的因素6. 讀出噪聲(R)
在信號較弱的成像中，來自信號的散粒噪聲較小；而暗電流的散粒噪聲（即暗噪聲）在當前的高端科研相機都是很低的，在曝光時間1s這個量級甚至更短的時候，暗噪聲通常可以忽略；此時讀出噪聲（即信噪比公式中的"R"）就稱爲特別需要考量的因素了。
對於同樣的芯片，讀出噪聲的大小與讀出速度有關，無論對於CCD相機還是sCMOS相機，讀出速度越快，讀出噪聲越高。而sCMOS相對於CCD的一個核心優勢，就是高速讀出時依然能夠保持極低的讀出噪聲。
讀出噪聲的重要性也使得其和QE一起變成了相機被重點關注的兩個參數。單純考察兩者中的一個優勢並不能正確預測成像的信噪比。如圖9所示，同樣拍一個綠色熒光樣品，QE較高的ORCA-Spark成像質量卻不如ORCA-Flash 4.0 LT，就是因爲ORCA-Flash 4.0 LT的讀出噪聲較低，綜合考慮時ORCA-Flash 4.0 LT的信噪比更好。
圖9. 讀出噪聲對信噪比的影響
小結：如果用於弱信號探測，相機的讀出噪聲對於總體的信噪比很重要。