高手開槓-‘1%的微生物可培養’到底爲哪般？（1）
主要羣落中高比例的細菌可培養
High proportions of bacteria are culturable across major biomes
The ISME Journal [IF:9.504]
DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-019-0410-3
第一作者：Adam C. Martiny1，2
通訊作者：Adam C. Martiny([email protected])1，2
主要單位：
1美國加州大學歐文分校地球系統科學系(Department of Earth System Science, University of California,
Irvine, CA 92697, USA)
2美國加州大學歐文分校生態與進化生物學系(Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of
California, Irvine, CA 92697, USA)
寫在前面
關鍵字：1%可培養、細胞、類羣、親緣關係
點評：作者圍繞自己的中心論點“1%的範式不再正確”通過詳細的數據分析進行有理有據的論述，作者對一直以來含糊不清的概念“1%可培養範式”進行了深層次的剖析，從三個層面闡述了對這一觀點可能的解釋，比較其區別並運用來自6個主要生物類羣40個羣落的數據用事實說話，論證有力，推翻‘1%細胞版本’(H1)與‘類羣的1%版本’(H2)，並輕而易舉的順便推翻（H3）版本，最終提出自己的觀點即應該更新“1%的可培養性範式”，用現有技術培養的來自各種環境的細胞(H1)或類羣(H2)遠遠超過1%。
摘要
只有1%的微生物是可培養的，這一範式對我們理解微生物生態學產生了深遠的影響，並且仍然是大多使用分子工具來描述微生物羣落的主要動機。然而，這一點經常被模糊地表達，表明一些科學家對該範式有不同的見解。此外，在培養技術方面的實質性進展表明這種範式可能不再正確。爲了量化六個主要生物羣落中細菌的可培養性，我發現，已知可培養親緣細菌的16S rRNA相似性中值爲97.3±2.3% (s.d.)。此外，52.0±24%的序列和34.9±23%的類羣(定義爲>97%相似性)有一個密切相關的可培養的親緣關係。因此，許多環境中的的細胞和類羣可以用已知的技術進行培養，這表明1%的範式不再正確。
正文
一直以來，微生物的多樣性和生理機能是通過培養技術來評估的，但是16S rRNA測序顯示了高度未被認知的多樣性，導致目前只有1%的微生物是可培養的這種模式。這一範式對微生物學領域產生了深遠的影響，並一直被作爲利用與開發新分子技術來表徵微生物羣落特徵的動力。
在文獻中，對“1%可培養範式”似乎有三種的解釋。第一種解釋(H1)指一個羣落中1%的細胞可以培養。這一解釋表明，即使使用所有現有的方法，也只能從樣本中培養出1%的細菌細胞。第二種解釋(H2)是指一個羣落中只有1%的類羣可被培養——同樣使用所有可用的方法。在這裏，一個類羣被定義爲一組密切相關的有機體(例如，使用序列相似性準則)。第一種解釋和第二種解釋的區別在於，第二種解釋對豐富的和罕見的類羣給予同等的重視。第三種解釋(H3)更具操作性，指的是假設在標準瓊脂培養基上，一個羣落中有1%的細胞生長。第三個版本是基於以下觀察:與直接染色技術相比，平板計數嚴重低估了細菌的丰度和多樣性。
“1%可培養範式”的起源相當模糊。許多論文參考Torsvik和Øvreas或Amann和同事的論述。然而，前者並沒有提供參考或分析來支持該範式。Amann和他的同事提供了一個表格來比較瓊脂平板與直接計數，所以H3可能是最初的解釋。與此相反，谷歌學術搜索顯示，目前使用的“1%的可培養範式”似乎更多是指H1或H2的解釋，儘管這一點經常被含糊地表達出來且很難歸類。幾十年來，人們共同努力在不同的環境中培養出了大量的微生物，且在方法上也有了很多改進。一直以來，在大多數生物羣落中，豐富的譜系所佔比例很低，但我推測，最近培養方法的創新和人們不斷地努力導致了今天更高的可培養細菌的比例。因此，我預計用現有技術培養的來自各種環境的細胞(H1)或類羣(H2)遠遠超過1%。
在這裏，我們對來自6個主要生物類羣40個羣落的已知可培養親緣微生物的比例進行了量化(人類相關，海水，海洋沉積物，淡水，土壤，空氣)。因爲這些序列較長，分析僅限於桑格測序，而且由於可以跑重疊序列，出錯率通常較低。從每個樣本中隨機提取100個序列，針對基於RDP分類出的已知可培養微生物使用‘SeqMatch’進行比較。
爲了測試1%細胞版本的範式(H1)，我們將直接擴增的16S rRNA序列與已知分離物進行相似性比較。擴增子序列和分離物在所有生物羣落中的相似度中值爲97.3±2.3% (s.d.)，但在不同的生物羣落類型中存在顯著差異(1-way ANOVA, p < 0.0001, Fig. 1a)。在與人類相關的羣落中，分離物的相似度中值爲>99%，而在海洋沉積物中相似度僅爲~93%(Fig.1a)。如果我們一開始就將“親緣關係密切”定義爲至少97%的16S rRNA相似的序列，那麼平均52.0±24%的序列與已知分離株具有密切的關係，但這一比例在整個生物羣落中存在顯著差異(1-way ANOVA, p < 0.0001, Fig.1c)。直接檢索到的序列與已知分離株之間高的中值相似性，以及具有密切相關可培養親屬的高比例的序列表明，目前對“1%可培養性範式”H1解釋的支持有限。
圖1. 羣落成員與已知分離株之間的16S rRNA序列相似性
16S rRNA sequence similarity between community members and known isolates
a. 擴增子序列和已知分離株的中值相似度作爲“1%可培養性範例”的測試，H1。
b. 代表性的擴增子序列與已知分離株的中值相似度作爲H2的測試。誤差棒代表標準誤差。
c.在整個生物羣落中，具有親緣關係的序列所佔比例的箱形圖。
整個生物羣落中分佈的在培養中有親緣關係的類羣比例。一個分類單元（可培養且具有密切的親緣關係）在這裏被定義爲具有>97%相似性的16S rRNA序列，並使用MOTHUR通過opticlust算法進行binned。對於箱形圖，灰色線是中值，箱形圖下上邊框是25-75百分位，誤差棒是觀察值的2.5-97.5百分位。
通過比較每個分類單元(使用MOTHUR按97% 16S rRNA相似性分組)的一個代表與已知分離株之間的相似性來測試‘類羣的1%’(H2)的解釋。在這裏，類羣與已知分離株的相似度中值爲95.4±2.9%，但在不同生物羣落間也存在顯著差異(one-way ANOVA, p < 0.0001, Fig.1b)。來自人類相關羣落的分類羣與已知的分離羣相似度最高，而來自沉積物的類羣與已知的分離羣相似度最低。值得注意的是，與人工培養的類羣相比，序列的比例並不總是遵循相同的趨勢。對於海洋羣落來說，超過50%的序列，但只有35%的分類羣有已知的培養親緣關係，而在其他生物羣落中幾乎看不出有什麼不同——這可能是爲了分離出豐富的海洋譜系而協同努力的結果。在整個生物羣落中，平均34.9%的類羣至少有97%與已知的分離株相關，而在不同生物羣落中，這一比例存在顯著差異(one-way ANOVA, p < 0.0001, Fig. 1d)。生物羣落中可培養代表的差異部分是由alpha多樣性剖面驅動的，即更多樣化的羣落(如沉積物)包含更低比例的可培養代表。然而，在培養中所代表的序列(H1)和分類羣(H2)的比例遠遠高於1%，這表明對“1%的可培養範式”的版本1或版本2的支持是有限的。
我接下來想要測試的是，已知親緣關係的微生物的比例是否受到序列庫大小的影響。事實上，與可培養親屬關係密切的類羣所觀察到的比例(而不是序列)取決於序列庫樣本的大小。因此，“稀有生物圈”的包含範圍隻影響H2而不影響H1,並且>100萬個短序列的樣本庫可能會產生較低比例的培養類羣。
已知親緣關係的序列或分類羣的比例預計將隨着決定某樣東西是相同還是不同的序列相似性閾值的定義而變化。97%序列相似性閾值是微生物生態學中常用的閾值，但是，在樣本中一個更嚴格的閾值會產生更低的可培養近緣類羣的比例，反之亦然(Fig. 2)。重要的是要認識到16S rRNA相似性與基因組相似性是非線性相關的。因此，這一發現對於理解微生物的可培養性是複雜的，因爲緊密相關的微生物有一些共同性但也有一些特異性。但是，更嚴格的閾值對在成熟的（和可培養的）羣體中分離株的培養，測序和報告工作很敏感，因爲這將導致更好的子分支代表。綜上所述，多樣性單位的定義對於我們如何解釋這一範式是很重要的。
圖2. 羣落成員和已知分離株之間的相似性作爲定義“密切相關”的功能序列的閾值
Similarity between community members and known isolates as
a function sequence threshold to define‘closely-related’
a. 在“親緣關係密切”的定義中，與可培養親緣關係相關的序列的比例(H1)。
b. 具有“親緣關係”定義的可培養近緣類羣的比例(H2)。
對於箱線圖，灰色線是中位數，箱形圖下上邊框是25-75百分位，誤差棒是觀察值的2.5-97.5百分位(n = 40)。在這裏，分類羣和親緣關係很近的類羣都是使用一系列序列相似性來定義的。
接受或拒絕“1%可培養性”的細菌模式取決於如何解釋該模式，如何定義多樣性單元，以及感興趣的生物羣落等關鍵細節。該範式的三個版本顯示了不同程度的支持。最開始的-細胞的1%-這一最常見的版本被明確地拒絕了，因爲細胞間中位數的相似性，以及現存的培養物在整個生物羣落中超過97%。對第二種-類羣的1%-版本的接受或拒絕則更加模糊。生物羣落中34%的類羣(以97%的序列相似性定義)在培養上有密切的親緣關係，但在不同的樣品中比例差異很大。類羣間可培養代表的程度也對庫的大小和相關的不太常見成員的出現很敏感。第三種解釋沒有被詳細分析，因爲很少有人會質疑在標準瓊脂平板上的培養嚴重低估了微生物的多樣性和豐富度(有幾個明顯的例外）。可培養代表的變異性部分與樣本的多樣性和丟失稀有成員的可能性有關，但整體培養的努力和對營養需求的認知也可能發揮作用。曾經有一段時間，所有的解釋都採用了“1%的可培養範式”，而許多(或大多數世系)不在培養中。然而，當使用傳統分類學定義時，在培養特別豐富的樣本方面所做的大量努力已使觀察到的比例遠遠高於1%。因此，現在是時候更新“1%的可培養性範式”，並認識到在不同的生物羣落中即使不是最豐富的血統，也有許多已經在培養中了。
Reference
Adam C. Martiny. High proportions of bacteria are culturable across major biomes.The ISME Journal (2019) 13:2125–2128
doi:10.1038/s41396-019-0410-3
高手開槓-‘1%的微生物可培養’到底爲哪般？（2）
大多數生物羣落中，高比例的細菌和古菌仍不可培養
High proportions of bacteria and archaea across most biomes remain uncultured
The ISME Journal [IF:9.504]
DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-019-0484-y
第一作者：Andrew D. Steen1，2
通訊作者：Andrew D. Steen([email protected])1，2
合作作者：Alexander Crits-Christoph,Paul Carini,Kristen M. DeAngelis,Noah Fierer,Karen G. Lloyd,J. Cameron Thrash
主要單位：
1美國田納西大學微生物學系(Department of Microbiology, University of Tennessee,Knoxville, TN 37996, USA)
2美國田納西州諾克斯維爾大學地球與行星科學系(Department of Earth and Planetary Sciences, University of
Tennessee, Knoxville, TN 37996, USA)
寫在前面
關鍵字：1%可培養、宏基因組、Meta分析、數據庫
點評：作者通過分析Martiny的數據開啓回懟模式，首先使出殺手鐗，指出他的結論是基於技術性的錯誤以及於一個概念上的錯誤，即尤其是序列相似性的計算沒有考慮到序列間隔，以及對16S rRNA基因擴增子的依賴，而這些擴增子被認爲偏向於可培養的生物體；以及序列相似性不能用來推斷“可培養性”，因爲人們不能從16S rRNA基因序列推斷生理機能。可謂是脣槍舌劍，火藥味十足，作者經過結合最近其他更可靠的研究，首先指出擴增16S rRNA基因的PCR引物具有偏向性，其次指出核糖體數據庫項目(RDP)提供的SeqMatch工具的不完善性，並通過使用自己的分析方法重新分析Martiny的數據來證明數據庫和分析選擇如何影響結果，並一一論述自己與Martiny在其他方面的分歧點與共同點，可謂是針鋒相對，刀光劍影，着實精彩，最終提出自己的觀點:大多數細菌和古細菌類羣仍未被培養。
摘要
Martiny在最近的一篇論文中指出，在多樣性的地球環境中，“高比例”的細菌可被培養。在這裏，我們重新分析了論文中的一部分數據，並認爲結論是基於幾個技術性錯誤，尤其是序列相似性的計算沒有考慮到序列間隔，以及對16S rRNA基因擴增子的依賴，而這些擴增子被認爲偏向於可培養的生物體。我們進一步論證，這篇論文也是基於一個概念上的錯誤:也就是說，序列相似性不能用來推斷“可培養性”，因爲人們不能從16S rRNA基因序列推斷生理機能。結合最近其他更可靠的研究，這些證據支持這樣的結論:大多數細菌和古細菌類羣仍未被培養。
正文
地球上有多少細菌和古菌細胞已經被培養?這個簡單的問題有一個複雜的答案。在1932年，Razumov發現基於培養的細胞計數產生的細胞丰度估計數遠遠小於顯微鏡計數。最近，人們發現許多微生物分類羣與實驗室菌株的親緣關係非常遙遠，它們屬於全新的科、目，甚至是沒有可培養代表的門。大多數細菌在門水平缺乏可培養的代表。鑑於微生物生理學具有這一自然發生的屬性即僅從序列數據很難推斷出它，因此，量化培養標本中所代表的地球上細胞的比例仍然是一項重要並且是必要的分析和概念上的挑戰。
在最近的一次簡短交流中，Martiny對這個問題的回答被總結爲:“在主要的生物羣落中大部分細菌可以被培養”，他的最後一句話是:“……在不同的生物羣落中，即使不是最豐富的譜系，也有許多已經在培養中了”。在此，我們認爲這些結論是基於不充分的和固有偏見的數據和分析，以及錯誤的邏輯，即如果一個有機體，其16S rRNA基因序列是>97%相似於實驗室中培養的，則它是可培養的。下面，我們強調現有的證據，大多數環境中的大多數細胞與已培養的有機體只有遠親關係。
首先，Martiny依靠全長的pcr擴增的16S rRNA基因序列來評估環境中微生物分類羣的豐富程度。通常用於擴增16S rRNA基因的PCR引物偏向於某些確定的類羣，完全忽略了新發現的譜系，其中一些可以從宏基因組中鑑別出來。因爲環境DNA的鳥槍測序不依賴於測序前特異性序列的PCR擴增，所以它不像基於擴增的方法那樣有偏倚。因此，預期宏基因組包含16S rRNA基因序列的比例更接近其在環境DNA中的絕對丰度。最近的一項Meta分析比較了從擴增子或宏基因組數據庫中檢索到的16S rRNA基因序列，結果表明，針對16S rRNA基因的常用引物在大多數公開可用的數據庫中產生了相當豐富的可培養生物。雖然引物分析和宏基因組分析之間的差異大小取決於PCR引物的選擇和所涉及的環境，但基於PCR的可培養性評估相對於以宏基因組爲基礎的研究，在很大程度上且一貫地過高代表了培養生物的比例。爲了估計這種影響的程度，我們使用Lloyd等人最初報道的數據，在14種廣泛的環境類型中的每一種中，將通過PCR擴增獲得的16S rRNA基因序列的丰度與從宏基因組文庫中獲得的丰度進行了比較。根據IMG/M的報道，測定宏基因組文庫中的序列丰度爲每個序列的讀長招募的中位數，該中位數表示從每個樣本中提取的DNA中每個16S rRNA基因序列的丰度。我們注意到，pcr擴增數據和宏基因組數據來自不同的研究，因此它們代表了環境中的趨勢，而不是對來自相同樣本的結果進行面對面的比較。
其次，Martiny使用了由核糖體數據庫項目(RDP)提供的SeqMatch工具確定環境中16S rRNA基因序列和分離物之間的序列相似性。SeqMatch報告一個“相似度評分”，它不包括內部的間隔對齊位置，只報告對齊的鹼基之間的差異。這個分數的計算方法不同於全長序列之間的普遍的身份分數，後者包括BLAST、USEARCH、CD-HIT、UPARSE和mothur等程序的默認分數，這些程序將內部序列插入和刪除算作生物學上的有效差異。因爲16S rRNA基因的長度可以有相當大的差異，所以間隙是進化距離的重要標誌。SeqMatch工具還報告了RDP比對中最佳命中的序列標識，RDP比對並不比對16S rRNA基因中的高變區，但這些區域最有可能包含物種間的替換。此外，由SeqMatch鑑定的1-2%的序列作爲Martiny分析中與環境序列最接近的分離物被錯誤地識別爲分離物，並可追溯到未知的環境序列。這些數據庫錯誤可能會導致高估培養序列的丰度。最後，每個樣本只能分析100個序列，這也可能大大低估了從給定的樣本中識別的類羣的數量。
爲了證明數據庫和分析選擇如何影響結果，我們重新分析了Martiny分析的來自Jangid等人的和Santelli等人中的所有序列，以及由Karst等人獲得的48,000個有代表性的OTU序列(Fig.1)。Karst等人的數據集是使用基於物理濃度、大小選擇以及小亞基rRNA分子的短讀長和長讀長測序的新方法生成的，這種方法不存在引物偏倚。我們使用mothur包中的alignseqs命令向SILVA數據庫(47917個序列)中報告的分離株和類型菌株報告序列標識(把內部的而不是外部的序列間隔算作生物學差異)並向根據RDP的“隔離過濾器”過濾到僅包含分離株的RDP數據庫版本(513426個序列)報告序列標識。我們發現，與Martiny報告的序列標識相比，序列標識的中位數最佳命中率較低，而且在沒有引物偏差的數據集中，與PCR研究相比，具有>97%標識的序列的分離百分比通常要低得多。在Karst等人報道的代表性OTU序列中，只有6%的序列在較大的過濾RDP數據集中對任何隔離物的識別度爲>97%。方法在補充中有更詳細的描述。我們的校訂結果更接近於一個大型數據庫中的發現，包括幾乎所有已發表的宏基因組，其中2-18%的16S rRNA基因序列是>96.6%，類似於一個培養微生物的序列。96.6%的相似度是屬內中位數序列一致性上的95%置信區間的上限。同樣值得注意的是，另一項使用SILVA數據庫的研究僅得出全長序列的結論，即“18.9%的細菌序列和6.8%的古細菌序列來自被分離的生物體”，儘管在門之間存在很大的差異。然而，沒有哪個門是來自大多數可培養的生物的序列(Table 1)。
圖1. 基於數據庫SILVA和RDP評估擴增子樣本序列相似度
根據Martiny2019年分析的==a==中兩項基於pcr的研究，從SILVA數據庫(左欄)和RDP數據庫的過濾版本(右欄)中分離出16S rRNA基因序列，獲得的最佳環境序列識別率，與==b==中一組大的、沒有引物偏倚且來自不同環境的複雜的OTU序列。
Best hit percent identities of environmental sequences to both
isolate 16S rRNA gene sequences in the SILVA database (left column)
and a filtered version of the RDP database (right column) from a two
PCR-based studies analyzed in Martiny 2019, and b a large set of
dereplicated OTU sequences free from primer bias and from diverse
environments每個數據集的最佳命中率標識的中位數用紅線標記，而在>97%標識的最佳命中率的序列的百分比用綠色標記
表1.利用PCR擴增技術從不同分類新穎性水平的生物體中富集的16S rRNA基因序列
值的計算方法爲:在4743個基於擴增子的數據集中，16S rRNA基因序列的中位分數與1504個未擴增的宏基因組中16S rRNA基因序列的中位讀長深度之比。（數據來自Lloyd等人的圖2和圖3）
Enrichment of 16S rRNA gene sequences from organisms at different levels of
taxonomic novelty due to PCR
amplification, values are calculated as the ratio of the median fraction of 16S rRNA gene sequences in 4743
amplicon-based datasets to the median read depth of 16S rRNA gene sequences in 1504 unamplified metagenomes. (Data from figures 2 and 3 of Lloyd et al.)
最後，我們在“可培養性”和16S rRNA基因序列相似性培養兩者之間的概念聯繫上意見分歧。97%的16S rRNA基因序列相似性閾值常被用來將微生物分組成不同的物種，而且在這一閾值內的微生物通常具有許多對可培養性很重要的特徵。然而，在同一物種的菌株之間存在大量的基因組和表型多樣性，這對生物體的生態功能和培養條件具有重要意義。生理狀態也會影響培養產量:例如，不同的休眠率可以對單個種羣的可培養性評估產生深遠的影響。因此，不可能僅根據16S rRNA基因序列來可靠地評估一個生物體是否“可培養”。
我們同意Martiny的觀點，即在所有環境中只有1%的微生物細胞是可培養的這一個經常被重複的公理應該退休了。正如Martiny清楚地指出的那樣，這句話的確切含義往往模糊不清，源數據也很難確定。最近的一項Meta分析發現，在直接計數中發現的細胞中，使用標準的技術可以培養出中位數是0.5%的細胞，但差異很大(四分位數的範圍從0.025到4.3%; Fig S1)。個別研究發現，在各種不同的環境中，如人類腸道、海洋表層沉積物和最近沉積有火山灰的湖泊，可培養的量可達70%或更多。此外，術語culturable只在特定的培養條件下有意義，這是Martiny在(H1)(1%的細胞可以培養)和(H3)(1%的細胞會在標準瓊脂板上生長)之間描繪出的一個區別。爲了描繪微生物羣落特徵而進行培養的努力應該依賴於多樣化的方法和培養基，以最大限度地提高的產量，而方法學的創新爲培養以前未培養的類羣打開了大門。
因此，我們認爲，不可能知道一個微生物是否是可培養的，直到它被培養出來，所以應該避免使用“unculturable”這個術語而使用“uncultured”。從歷史上看，在實驗室中培養和研究微生物對於我們瞭解微生物在我們周圍世界的作用是不可或缺的，甚至在生物信息學時代它仍然是必不可少的。爲了瞭解我們對微生物世界的描述程度，我們需要檢測地球上與可培養細胞具有相同生理結構的微生物細胞的比例。正確估計這一數字是一個重要的學術問題，但它也對資助機構的資源分配產生影響。我們希望未來的培養工作能夠取得足夠的成功，使來自大多數環境的大多數細菌和古生菌都能在培養標本中有代表。然而，目前最好的證據表明，情況遠非如此。
Reference
High proportions of bacteria and archaea across most biomes
remain uncultured.The ISME Journal (2019) 13:3126–3130
doi:10.1038/s41396-019-0484-y
高手開槓-‘1%的微生物可培養’到底爲哪般？（3）
“1%可培養性的範式”需謹慎定義
The ‘1% culturability paradigm’ needs to be carefully defined
The ISME Journal [IF:9.504]
DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-019-0507-8
第一作者：Adam C. Martiny1，2
通訊作者：Adam C. Martiny([email protected])1，2
主要單位：
1美國加州大學歐文分校地球系統科學系(Department of Earth System Science, University of California,
Irvine, CA 92697, USA)
2美國加州大學歐文分校生態與進化生物學系(Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of
California, Irvine, CA 92697, USA)
寫在前面
關鍵字：1%可培養、細胞、類羣、序列
點評：生死看淡，不服就幹，Martiny毫不示弱指出物體什麼時候是相同的或不同的，取決於一個人是如何定義這個問題的，以及基於測試它的特定的環境，你會得到不同的答案；並指出
Steen和他的同事的分析是對H2範式的測試，其分析中增加罕見成員或測序錯誤的代表應該會導致觀察到低的可培養性，並分析指出他們對類羣相似性進行狹義的定義也能得出大多數微生物類羣還沒有被培養。Martiny也通過海洋藍藻原綠球藻來舉例論證表明答案是根據你的標準而異，最後指明我們的研究方向。
正文
在ISME雜誌的評論中，Steen和他的同事對我最近對微生物可培養性的分析表示擔憂。我的分析挑戰了長期存在且經常被重複的“1%可培養性範式”，即大多數微生物不能被培養。首先，我認爲該範式的定義很模糊，但至少可以分爲三個假設:(H1)一個羣落中1%的細胞可以培養，(H2)一個羣落中1%的類羣可以被培養或者(H3)羣落中1%的細胞能在標準瓊脂培養基上生長。第二個難題集中在如何定義兩個有機體是相同的還是不同的，關於這一點的討論充斥着各種研究。狹隘的相似性定義將不可避免地導致微生物羣落在培養標本中的代表性降低，這是由於微生物的絕對豐富性和序列變異造成的。物體什麼時候是相同的或不同的，取決於一個人是如何定義這個問題的，以及基於測試它的特定的環境，你會得到不同的答案。然而，我表明，如果你應用最常見的範式解釋(H1)和通常的類羣相似性定義(約97%的16S rRNA相似性)，你會得出結論，許多特別豐富的譜系已經在不同的環境中被培養。
Steen和他的同事對這一結論提出了質疑，但沒有確定他們質疑的是哪種範式。我不懷疑他們分析的質量，他們結論的差異似乎支持了我最初的觀點，即框架問題很重要。我將他們的分析解釋爲對H2的測試，因爲他們複製了序列文庫，從而消除了分類丰度效應。在我最初的分析中，H2的解釋對包含稀有序列變體很敏感。這些罕見的變異中有一些是真正的生物體，而另一些則可能是測序錯誤。許多最近的培養工作已經集中在豐富的血統。因此，在您的分析中增加罕見成員或測序錯誤的代表應該會導致觀察到低的可培養性。Steen和他的同事也主張對類羣相似性進行狹義的定義。他們說，“在一種微生物被培養出之前，不可能知道它是否可以培養”，而且“在同一物種的菌株中可能存在大量的基因組和表型多樣性。”因此，他們得出的結論是大多數微生物類羣還沒有被培養就不足爲奇了。
不同的解釋可以用豐富的海洋藍藻原綠球藻來很好地進行闡明。在海洋中有~10 27個原綠球藻細胞，在培養中有代表大多數亞支~50個不同的分離株。培養實驗揭示了原綠球藻許多共同的生理機能(和變異)，但測序也發現，關鍵性狀和特定的基因型在分離株中缺失。原綠球藻是可培養的(culturable) and/or已經被培養了(cultured)?答案根據你的標準不同而不同。
就我個人而言，我多年來一直視‘1%的可培養範式’是試圖分離微生物的一種阻礙——我懷疑其他許多微生物也受到了阻礙。我們正在開發越來越複雜的用於原位微生物羣落分析的分子技術，然而很少有基於培養的模型系統被提出。然而，一些(但太少)研究表明，應用傳統的技術，如稀釋至滅絕或使用基質不足的瓊脂板，可以分離出許多豐富的微生物譜系。我希望通過這項工作說明，自從提出1%的可培養性範式以來，我們在培養來自多種環境的豐富血統代表方面已經取得了很大的進步，我們應該繼續沿着這條道路前進。
編譯：馬騰飛 南京農業大學
責編：劉永鑫 中科院遺傳發育所
Reference
Adam C. Martiny. The ‘1% culturability paradigm’ needs to be carefully defined.The ISME Journal
doi:10.1038/s41396-019-0507-8
文檔：學術界的battle：1%可培養的微生物
鏈接：https://mp.weixin.qq.com/s/6NNYPjlJn8bmI2uTB1piDw
猜你喜歡
10000+：菌羣分析 寶寶與貓狗 梅毒狂想曲 提DNA發Nature Cell專刊 腸道指揮大腦
文獻閱讀 熱心腸 SemanticScholar Geenmedical
16S功能預測 PICRUSt FAPROTAX Bugbase Tax4Fun
生物科普: 腸道細菌 人體上的生命 生命大躍進 細胞暗戰 人體奧祕
寫在後面
爲鼓勵讀者交流、快速解決科研困難，我們建立了“宏基因組”專業討論羣，目前己有國內外5000+ 一線科研人員加入。參與討論，獲得專業解答，歡迎分享此文至朋友圈，並掃碼加主編好友帶你入羣，務必備註“姓名-單位-研究方向-職稱/年級”。PI請明示身份，另有海內外微生物相關PI羣供大佬合作交流。技術問題尋求幫助，首先閱讀《如何優雅的提問》學習解決問題思路，仍未解決羣內討論，問題不私聊，幫助同行。
學習16S擴增子、宏基因組科研思路和分析實戰，關注“宏基因組”
