From single gene analysis to single cell profiling: a new era for precision medicine
Single-cell sequencing in cancer research
High-dimensional immune-profiling in cancer: implications for immunotherapy
Single-Cell RNA Sequencing in Cancer: Lessons Learned and Emerging Challenges
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DNA和RNA的分子分析爲非惡性和惡性疾病的遺傳基礎提供了有價值的新見解，也增加了對調節人類疾病基本機制的理解。最近的技術進步使基於基因的結構和功能變化的分析全面、高通量的方式展示，每個腫瘤類型通常對應着一個或多個關鍵調節細胞生長和增殖或者逃避免疫系統的通路。
如下圖，慢性髓系白血病幹細胞(CML-SCs)的單細胞轉錄組分析。新靶向BCR-ABL的Smart-seq-2(BCR-ABL tSS2)獲得單細胞突變檢測和RNA測序可以研究CML-SCs的異質性，並確定耐藥SCs的亞羣。這種方法允許在耐藥細胞中識別基因和通路的失調，這可能有助於預測疾病對治療的反應。
長期以來，Tumor的異質性一直困擾着癌症生物學家和遺傳學家。由於基因組工具缺乏準確地測量腫瘤中的單個細胞，我們依賴於平均測量或單一標記，從而掩蓋了ITH(intra-tumor heterogeneity)的許多關鍵方面，阻礙了我們對腫瘤生物學的理解。腫瘤中單細胞程序的精確描述使細胞生物學處於癌症生物學的中心地位。通過測量轉錄作爲細胞類型和細胞遺傳學的功能，這些努力爲重新理解癌症的起始和進化奠定了基礎。通過實現信號的反褶積和突出ITH的未預期模式，癌症單細胞計劃的綜合分析也闡明瞭基於bulk 測量tumor分類。雖然對易感染性疾病的瞭解在一開始似乎令人生畏，但常見的細胞狀態和程序正在出現，並提供了新的候選靶點，可用於治療。這裏討論的初步研究是人類癌症單細胞基因組令人興奮時代的開始;他們正在爲更多的發現鋪平道路，這些發現將來自改進的技術、分辨率、計算方法和更廣泛的臨牀環境。
細胞類型，細胞狀態，惡性和非惡性細胞
腫瘤表達多樣性的分析通常顯示兩層：高度不同的Cluster也許被認爲是“細胞”(例如,惡性腫瘤細胞、T細胞和成纖維細胞)和進一步的多樣性在每個clusters可能被視爲“細胞狀態,”如pro-gression沿着細胞週期，不同的代謝狀態或其他動態程序。細胞類型和狀態基於優先表達的基因(在每個集羣或subcluster)以及其結構信息，包括大規模的拷貝數改變(CNAs)，點突變，融合蛋白。這些信息可以從scRNA-seq數據推斷出，並幫助解決惡性腫瘤從良性細胞轉移來的規律。最近的scRNA-seq研究的一個新主題是，惡性細胞在其表達譜中傾向於主要根據患者樣本聚類，而非惡性細胞在其表達譜中傾向於細胞類型聚類，在某種程度上獨立於患者的來源（個體異質性）。這表明
- 1)腫瘤間的異質性比任何特定類型的非惡性細胞都更特異。
- 2)對於惡性細胞，腫瘤間異質性遠大於腫瘤內異質性。
這些結果突出了腫瘤間相當程度的異質性，並可能被誤解爲反映了腫瘤細胞的腫瘤內異質性的有限作用。然而，單細胞方法的強大之處在於，它們現在進一步允許我們對腫瘤內異質性的特徵進行研究，這些特徵很難用以前的方法來評估，而且通常是連續的，而不是離散的。
最近臨牀成功的免疫檢查點封鎖和嵌合抗原受體(CAR-T) T細胞療法代表一個轉折點。如下圖，展示近20年來癌症免疫治療的里程碑。
免疫治療是一個快速發展的癌症治療領域。與傳統的癌症療法相比，免疫治療策略側重於重新激活免疫系統，以產生抗腫瘤反應。儘管臨牀試驗取得了令人鼓舞的結果，但仍有很大比例的患者對治療沒有反應，許多患者經歷了不同程度的免疫相關不良事件。此外，現在人們越來越認識到，即使是許多傳統的癌症治療，如放療，也可以對宿主免疫系統產生積極的影響，從而提高臨牀反應。因此，有必要更好地瞭解腫瘤免疫以便設計免疫治療策略，特別是循證聯合治療以提高臨牀療效。基於這一目標，癌症研究將注意力轉向分析腫瘤微環境(TME)或外周血的免疫背景，以揭示其機制和生物標記，這可能有助於精確的免疫治療。用於這一目的的傳統技術受到數據深度和維數的限制。然而，新技術的進步大大提高了可獲得數據的廣度和深度以及數量和質量。這些進展的結果是豐富的新信息和見解，關於TME如何可能被不同的免疫細胞類型影響以及這如何可能反過來影響癌症患者的臨牀結果。在此，我們重點介紹目前在癌症免疫圖譜中使用的一些高維技術，並總結了這些技術在設計更好的癌症免疫療法時可能帶來的見解和潛在益處。
腫瘤微環境(TME)是複雜的，包括腫瘤細胞、浸潤性免疫細胞、成纖維細胞、腫瘤血管系統和細胞外基質。這些不同的腔室現在被認爲在腫瘤發生、癌症進展、轉移甚至對治療的反應中起着相互作用和共同作用。腫瘤的免疫環境，即不同免疫細胞羣的位置、密度和功能定位，已被證明是決定疾病預後和各種癌症治療的療效，特別是快速發展的癌症免疫治療。與傳統的癌症療法不同，免疫療法以患者的免疫系統或TME爲靶點，誘導抗腫瘤免疫反應。免疫治療策略包括細胞因子治療、腫瘤疫苗、過繼T細胞治療和免疫檢查點阻斷(immune checkpoint blockades，ICB)。雖然使用免疫療法，特別是ICBs的臨牀試驗結果很有希望，但仍有很大一部分患者對治療沒有反應。許多患者還經歷了治療相關的自身免疫性毒性或免疫相關不良事件(irAEs)。因此，爲了理解背後的響應機制和irAEs (或缺乏)免疫治療，人們試圖對TME或外周血的免疫環境進行分析，目的是發現可能對一個增強臨牀指導治療的新策略和生物標記物。
用於免疫分析的各種技術可分爲兩大類：
- 基於轉錄組的技術
- 基於蛋白質組的技術。
傳統技術的許多限制，如較少的可用分析參數，需要大量的樣本和相互重疊的檢測，逐漸被新的高維技術改善。這些當前的前沿技術爲研究人員提供了前所未有的能力，可以深入研究TME或癌症患者外周血免疫表型。這篇綜述強調了最新的高維技術用於癌症的免疫分析，並研究了它們可能帶來的見解和潛在的好處，特別是對推進癌症免疫治療的進展。
癌症中的常規免疫分析工具
早期的免疫分析技術爲腫瘤與免疫細胞相互作用背後的機制提供了有價值的見解，並促進了在疾病預後的生物標誌物發現和治療反應預測方面的突破。這些技術包括bulk 轉錄組分析，如基因芯片和bulk RNA測序(RNA- seq)，以及低維蛋白基礎平臺，如早期基於熒光的流式細胞術和傳統的免疫組織化學(IHC)。
儘管如此，這些技術有其固有的侷限性，這限制了對腫瘤免疫景觀的深入理解。例如，傳統的bulk 轉錄分析，如微陣列和RNA序列分析，依賴於從腫瘤組織中集合的細胞羣中提取RNA。因此，這種bulk 轉錄組方法妨礙了稀有細胞類型的識別，也妨礙了具有相似表達模式的細胞之間或腫瘤細胞與免疫細胞之間的分辨。它也限制了對單個細胞類型的功能和/或表型的理解。
對於基於蛋白質的分析，技術的進步和新熒光色素和激光探測器的發展使最先進的流式細胞儀能夠同時常規測量多達18種不同的蛋白質標記物。然而，傳統的基於熒光的流式細胞術受到熒光色素髮射光譜重疊的限制，使用更多的熒光色素加重了這個問題。這使得在這個平臺上對細胞表型進行詳細的檢查變得困難，因爲在生物系統如腫瘤中需要更多的參數來區分複雜的免疫亞羣。
最後，傳統的免疫組化或免疫熒光顯微鏡可以使用酶標記或熒光標記抗體檢測組織切片內的細胞抗原，並有助於識別細胞類型及其在組織內的空間位置。然而，由於顯色或熒光光譜重疊，不能同時使用超過4個標記。因此，傳統的免疫組化技術在捕獲腫瘤浸潤免疫細胞中存在的免疫表型的異質性和複雜性程度方面也存在不足。
因此，儘管上述傳統技術提供了腫瘤免疫全景的良好圖景，但它們可能無法有效捕獲TME內動態系統中免疫表型的複雜性和深度以及潛在功能線索。
下一代癌症免疫圖譜的高維技術
爲了滿足捕獲細胞異質性和檢測罕見免疫亞羣的需要，技術已經向單細胞能力和高維分析的新技術發展，如單細胞RNA-Seq (scRNA-Seq)、（cytometry by time of flight）細胞計數(CyTOF)和多重免疫組化(mIHC)。這些技術克服了傳統免疫圖譜技術的諸多侷限性，在生物標誌物的發現和免疫機制的理解上取得了突破性進展，特別是在腫瘤免疫學領域。
scRNA-Seq的發展解決了bulk 轉錄數據的侷限性，使其在單細胞間的表型和功能異質性分析中更加有用。它建立在RNA- seq的概念上，加上分離單個細胞的額外步驟，接着是一個多重擴增過程，從微小的細胞RNA數量生成cDNA。這使得在單細胞水平上分析轉錄組成爲可能，同時保持了大量分析方法的準確性和複雜性。最近的進展加上組織成像能力提供了這些scRNA-seq數據的額外和有價值的空間信息。
除了scRNA-seq之外，轉座酶可達染色質測序的單細胞分析(scac -seq)也可用於研究表觀遺傳改變。 scATAC-Seq識別活躍的DNA調節元件，並允許在單個細胞水平快速和敏感的譜分析全基因組染色質可達性。
另一方面，CyTOF通過結合質譜和流式細胞術，使用與穩定的稀土金屬同位素(鑭系金屬)結合的抗體而不是熒光團，解決了傳統熒光流式細胞術有限的維數問題。樣品被霧化到單細胞液滴中，由高溫等離子體汽化產生一個帶有重金屬探針離子的離子云，然後使用質量-電荷比對其進行量化。由於這些金屬報告器在生物標本中不常見，所以產生的背景信號很小。最後，同位素的離散讀出很少或沒有重疊光譜。在單個細胞上可以檢測到40多個標記，而不需要結合更小的、單獨的抗體面板（panel），從而大大提高了細胞分析的維度。
最後，染料循環技術的進步，染色、成像和染料滅活是重複進行的，使得使用熒光顯微鏡在同一組織樣本上檢測到多達61種不同的抗原。與此同時，結合質譜的mIHC新技術已經被開發出來，可以使用結合CyTOF的激光消融組織同時成像32個蛋白，使用多路離子束成像(MIBI)同時成像35個和多達100個蛋白。基於大規模細胞瘤的mIHC技術是仍在發展中的有前途的技術。此外，在熒光成像硬件和軟件以及熒光染料方面的進展使得在單個切片上可以同時對多達7個熒光標記進行常規成像。這一突破克服了傳統免疫組化或免疫熒光共聚焦系統只能使用2 - 4個標記物的限制。
這些新技術產生的數據使研究人員能夠在單細胞水平上進行深度的免疫表型研究。更重要的是，這些先進的多維技術的組合正在越來越多地用於複雜免疫反應的研究，產生了使用老一代技術難以獲得的見解。下面幾節將介紹這些研究的一些重點。
多維免疫譜分析揭示了TME免疫亞羣表型和功能的複雜性
隨着能夠在單細胞水平上對免疫細胞進行深度分析，研究人員現在已經開始更好地認識到免疫反應的複雜性、免疫亞羣之間的相互作用以及TME中宿主和基質細胞之間的相互作用。如表1（略）所示，這些研究強調了單細胞高維分析捕捉TME細胞間可能存在的複雜網絡和關係的能力。他們也使免疫細胞類型的識別和幫助我們瞭解他們的存在可能會影響當地的抗腫瘤免疫反應(圖2)。這樣的複雜性和異構性在傳統bulk分析框架下是不可能感知的。
例如，在一項關於透明細胞腎細胞癌(CCRCC)的研究中，CyTOF被用來詢問T細胞和腫瘤相關巨噬細胞(TAM)人羣。T細胞上的耗竭標記，如TIM3和CTLA4的表達被發現是異質的，其中PD-1廣泛表達。提示抗pd -1免疫治療對CCRCC可能有效。此外，CD38+CD204+CD206- TAMs與免疫抑制T細胞表型相關，表現爲與PD-1+CD8+ T細胞和調節性T細胞(Tregs)呈正相關。這一發現通過mIHC (4-color)的觀察得到驗證，在mIHC中這些TAMs可以與腫瘤中的CD8+ T細胞共定位。在表徵T細胞和TAM羣體時，本研究提供了一個CCRCC的免疫圖譜，這將有助於理解免疫治療背後的機制。
同樣，Chew等人的一項研究使用CyTOF對肝細胞癌(HCC)的TME、鄰近的非TME和外周血單核細胞(PBMCs)進行了深度免疫分析。研究發現，關鍵的免疫亞羣，如T細胞、自然殺傷細胞(NK)和髓細胞在這三個隔室中富集不同。使用耗盡標記(PD-1、lag3)、免疫抑制標記(IL-10)和炎症反應標記(TNFa、IFNy、GzB)研究每個亞羣的功能表型。研究發現，與有肝炎感染慢性炎症背景的鄰近非腫瘤肝組織相比，TME內的免疫細胞更加疲勞和免疫抑制。 mIHC也被用於驗證在福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織上的CyTOF發現，顯示treg和耗盡的CD8+ T細胞確實在TME中富集。此外，pd -1表達的記憶性CD8+ T細胞丰度在晚期腫瘤中降低，表明它們在腫瘤進展中發揮作用。本研究深入瞭解了浸潤性免疫細胞在暴露於不同微環境時的不同表型和功能，認爲TME中免疫細胞處於更加衰竭的狀態，爲ICB療法在HCC中的成功應用提供了理論依據。
單細胞轉錄組技術的發展也使研究人員能夠更全面地捕獲TME內免疫亞羣的異質性，並追蹤它們的發育關係。在Zheng等對6例HCC患者的研究中，我們對從TME、非TME和外周血中分離出的5063個個體CD4+和CD8+ T細胞進行了scRNA-Seq，以解剖其轉錄組譜和T細胞受體(T cell receptor, TCR)序列。在HCC TME中發現了CD8+FoxP3+調節樣細胞等獨特的亞羣，並通過mIHC進行了驗證。我們還發現，與非TME或PBMC相比，TME內CD8+ T細胞和treg細胞的克隆性擴張更大。最後，在單細胞水平上定義TCR序列的能力使得研究這些T細胞簇的發育關係和激活狀態成爲可能。推測衰竭T細胞羣與中間發育羣體而不是完全分化的效應羣體關係更密切，使這些中間羣體成爲有吸引力的檢查點治療靶點。這些詳細描述HCC免疫系統發展和組成的大量數據對於理解和發展新的治療策略將是一個有價值的資源。
Azizi等人對乳腺癌進行了類似的scRNA seq研究，但從8名患者收集了47016個免疫細胞。作者發現，與正常乳腺組織相比，腫瘤組織中T細胞和髓細胞的異質性顯著增加，其獨特細胞亞羣的數量約爲正常乳腺組織的兩倍。對這種多樣性貢獻最大的基因與諸如炎症、缺氧和營養供應等信號通路有關，這表明在適應不利的TME時存在複雜的反應和改變。成對的scRNA-Seq和TCR測序也使作者能夠繪製每個細胞中TCR克隆的基因表達，他們的數據表明，T細胞的表型狀態可能受到TCR刺激和TME信號的影響。此外，在巨噬細胞中，M1和M2相關基因經常在相同的細胞中表達，挑戰了傳統的巨噬細胞極化表型模型。提取這些詳細信息的能力將有助於提高對免疫細胞在乳腺癌中的預防或抗腫瘤作用的理解。
Zhang等對結直腸癌(CRC)的另一項研究也使用了scRNA-Seq和TCR測序，繪製了從腫瘤組織、鄰近正常組織和外周血中分選的T細胞的分佈、克隆擴增、遷移和發育轉變。與之前的研究相似，他們發現腫瘤組織由CD8+和CD4+ T細胞組成，其表型更加衰竭、向外擴張和較少的可移動性，而正常組織和外周血則與較初始或近期激活的表型相關。作者還能夠根據TCR克隆類型分析這些跨組織類型的免疫亞羣之間的發育模式，並確定與t效應記憶細胞發育相關的CX3CL13+BHLHE40+IFNG+ th1樣細胞的羣體。這些細胞在CRC腫瘤中富集，表現出微衛星不穩定性，這是一種與抗pd1免疫治療反應相關的腫瘤表型。因此，單細胞技術使作者能夠更好地解釋成功免疫治療背後的機制，併爲將這些新T細胞作爲治療靶點提供了基礎。
對開放的、活躍轉錄的染色質區域的研究也可以爲TME的免疫細胞異質性帶來新的見解。Satpathy等人使用scat - seq檢測接受抗pd1免疫治療的基底細胞癌患者原發性腫瘤活檢的染色質譜。我們發現CD8+耗盡T細胞和T濾泡輔助細胞在治療後均有擴張。此外，這兩種細胞類型共享一組與分化相關的轉錄因子基序，表明在抗pd1免疫治療後，共同的基因調控程序推動了它們的發展。
Angelo等人描述的mIHC技術稱爲MIBI，在未來腫瘤組織的多重TME研究中具有巨大的潛力。36這種方法使用氧初級離子束來光柵化組織樣品表面，在相同視場的重複掃描週期中，技術上能夠檢測到多達100種不同的標記物。該技術於2014年首次被描述，現在已被改進爲全自動，並用於詢問三陰性乳腺癌(TNBC)的TME。通過36種靶向腫瘤相關蛋白、功能標誌物、免疫相關和免疫調節蛋白的標誌物，作者能夠構建TNBC的腫瘤免疫景觀，並將組織結構和細胞表型等特徵與患者的臨牀參數相關聯。例如，他們將TNBC中的腫瘤免疫組成和組織分爲三種類型:冷(免疫細胞少)、混合(腫瘤和免疫細胞混合在一起)和區隔(腫瘤和免疫細胞空間分離)，並發現區隔的組織與更好的生存相關。
最後，Lavin等結合多維技術對早期肺腺癌的免疫微環境進行了解剖。CyTOF和scRNA-Seq分析發現，與正常肺細胞相比，腫瘤巨噬細胞有明顯的特徵，腫瘤特異性巨噬細胞與肺內巨噬細胞基因表達的高比值與較差的患者生存率相關。與正常肺組織相比，腫瘤中淋巴細胞和抗原呈遞細胞(APCs)的表型也有明顯變化。如NK細胞、CD16+單核細胞、CD141+樹突狀細胞(DCs)減少，而腫瘤組織中PPAR型hi巨噬細胞富集。CD141+ dc在T細胞募集和三級淋巴樣結構的形成中尤爲重要。此外，腫瘤病變的這種免疫特徵與TNM分期無關，這表明針對這種固有免疫通路的免疫治療，特別是腫瘤浸潤骨髓亞羣，可能在早期就對患者有益。因此，結合使用scRNA-Seq、CyTOF和mIHC使作者能夠理解和解釋免疫細胞的相互作用如何有助於腫瘤的發生，並利用這些信息爲患者制定潛在的新的治療策略。
免疫治療生物標誌物的高維免疫分析
這些先進的高維技術除了能加深對TME中局部免疫應答的理解外，在篩選免疫相關基因和/或蛋白標記方面也具有很高的價值，這些基因和/或蛋白標記可能作爲預測癌症治療反應的潛在生物標記(表2，略)。
一項針對HCC的特殊研究研究了對y90放射栓塞(Y90-RE)的免疫應答，使用CyTOF對腫瘤浸潤的白細胞和PBMCs。45作者跟蹤了Y90-RE治療前和Y90-RE治療後的免疫應答，檢測到治療後pbmc中免疫亞羣的增加，如TNF - TNF -表達CD8+和CD4+ T細胞和APCs，表明Y90-RE治療引起了積極的系統性免疫應答。他們還發現，在治療前和治療後的pbmc中，對Y90-RE治療表現出持續治療反應的患者顯示CD8+ T細胞表達PD-1(提示預處理)和趨化因子受體CCR5和CXCR6(提示歸向腫瘤)的百分比較高。基於免疫標記在PBMCs預處理中的差異表達，建立並驗證了Y90-RE治療持續臨牀反應的預測模型。因此，進行深度免疫表型的能力可以指導臨牀反應的潛在預測性生物標誌物的發現，以幫助患者作出治療決定。基於免疫標記在PBMCs預處理中的差異表達，建立並驗證了Y90-RE治療持續臨牀反應的預測模型。
類似的預測免疫治療反應的研究也在黑色素瘤中進行。Krieg等也使用CyTOF對抗pd1免疫治療前後黑色素瘤患者的淋巴細胞和髓細胞進行了表徵，發現CD4+和CD8+ T細胞的頻率較低，而髓細胞的頻率較高。這也反映在TME中，反應者有更高頻率的腫瘤浸潤CD4+和CD8+ T細胞。此外，在抗pd -1治療前，患者外周血單核細胞中發現了更高頻率的具有抗原表達能力的CD14+CD16-CD33+HLA-DRhi單核細胞，因此預測其對治療和生存的反應更佳。46這些單核細胞也表達ICAM-1，提示處於更活躍的狀態。因此，本研究爲在抗pd1治療前對患者進行臨牀分層驗證免疫細胞特徵提供了理論基礎。
除了CyTOF, scRNA-Seq也被證明在尋找潛在的預測治療反應的生物標誌物方面非常有用。Sade-Feldman等人對基線和治療期間接受免疫檢查點治療的轉移性黑色素瘤患者的腫瘤活檢進行了單細胞分析。他們發現，根據基因表達，活組織檢查中的CD8+ T細胞可以聚集成兩種主要狀態:一種狀態與記憶、激活和存活(包括Wnt轉錄因子-7、TCF7)有關，另一種狀態與細胞衰竭有關。腫瘤中活化和衰竭的CD8+ T細胞的比例與患者對免疫治療的反應有關。隨後通過免疫組化染色驗證了這一點，即在基線和治療後，腫瘤組織中較高的記憶密度和激活的TCF7+CD8+ T細胞確實與更好的免疫治療反應相關。因此，本研究強調了scRNA-Seq在篩選可能受益於免疫治療的患者的腫瘤浸潤免疫細胞中潛在的生物標記物的能力。
生物標誌物的發現並不侷限於免疫細胞類型;在惡性細胞中也可能發現潛在的生物標記。Jerby-Arnon等利用scRNA-Seq報道了一種由黑色素瘤腫瘤細胞表達的免疫抵抗分子標記，該標記與CD8+ T細胞浸潤水平降低和對免疫檢查點治療的抵抗有關。作者通過mIHC驗證了這一點，結果顯示，該耐藥程序(p53、Myc、DLL3、HLA-A、c-Jun、SQSTM1和LAMP2)的表達模式與腫瘤組織中的T細胞排斥有關。此外，研究表明，這種耐藥程序可能被CDK4/6抑制劑調控。因此，scRNA-Seq提供了鑑定惡性細胞上可能預測免疫治療反應的生物標記物的能力，併合理地制定可能的藥物靶點來增強這種反應。
高維免疫監測也可用於識別免疫治療誘發的irAEs的潛在預測性生物標記物。例如，採用流式細胞儀、CyTOF和scRNA-Seq聯合分析聯合ICB或單ICB(抗ctla -4或抗pd -1)治療的晚期黑色素瘤患者循環B細胞的變化(預處理和治療後)。研究發現，免疫治療後整體B細胞數量顯著下降與聯合ICB後發病時間更短、irAEs級別更高有關，這可能爲免疫治療誘導的自身免疫提供了早期生物標誌物。此外，本研究發現，免疫治療後循環CD21lo B細胞激活增強和IFN-阻斷信號通路增加，提示該羣體可能是ICB的非預期靶點。因此，這些高維技術顯示了識別生物標記物以預測免疫治療誘導的irAEs的潛力，從而在臨牀中提供更好的治療策略。
需要承認的是，在許多這樣的研究中，特別是那些採用scRNA-Seq的研究中，納入的患者隊列很小，這就提出了樣本偏倚小的問題。儘管如此，它們顯示了這些高維技術在篩選潛在生物標誌物預測免疫治療後臨牀結果方面的能力(表2)，併爲在更大的患者羣體中驗證這些特徵提供了合理的基礎。
多維免疫分析技術的未來發展方向
單細胞、多參數技術的發展已經徹底改變了免疫圖譜的領域。儘管如此，在通量、可伸縮性和成本方面仍有很大的改進空間。新的分析技術和方法正在開發中，這將使研究人員能夠在更高的維度和深度上進行分析。
鑭標記抗體的使用和質譜檢測已經在組織成像中被探索，利用CyTOF的高維能力進行空間解析的蛋白質組測量。35除MIBI(如上所述)外，另一種激光消融FFPE組織並結合CyTOF mass cytometer可實現32-plex IHC蛋白及其修飾分析。這項技術後來被擴展到包括mRNA分析，使得在乳腺癌組織單細胞水平同時檢測3種mRNA和16種蛋白。在這項研究中，作者能夠研究HER2和CK19基因的mRNA和蛋白水平之間的單細胞相關性。他們還發現，表達CXCL10(一種T細胞趨化劑)的細胞經常聚集在一起，並與樣本中較高頻率的T細胞相關。隨着多路複用能力的提高，這項技術在進一步研究TME中mRNA、蛋白質和信號網絡之間的關係方面具有巨大的潛力。與傳統的免疫組化相比，這些基於mass - cytomgraphy的組織蛋白組成像技術擁有一些優勢。一是背景或樣品的自發熒光信號減弱，鑭系金屬報告器之間的光譜重疊很少或沒有。此外，mIHC還能提供TME內免疫細胞的空間或定位信息。最後，mIHC技術能夠最大限度地獲取大量信息，使我們能夠充分利用具有長期患者隨訪歷史的豐富常規存檔的FFPE臨牀樣本。
RNA測序目前也正在探索作爲進行空間研究的工具。在一種稱爲空間轉錄組學(ST)的方法中，31個寡核苷酸被固定在帶有點陣列的玻璃載玻片上，每個點陣列包含一個位置條形碼。低溫保存的組織切片被安裝在這些載玻片上並進行成像，接着是組織mRNA的通透性和反轉錄。在探針從載玻片中釋放出來並測序之後，位置條形碼允許基因表達與其在組織中的原始位置匹配。這使得基因的空間表達，儘管是體積，可以從組織切片的特定位置來確定。這種技術的主要限制是缺乏單細胞分辨率，因爲每個這些點捕獲了來自同一區域的至少10個或更多細胞的轉錄組。作爲該方法的擴展，我們將scna -seq與ST整合，分別從同一組織的一半進行scRNA seq和ST檢測，並通過比較scRNA seq定義的基因簽名與在同一區域富集的ST基因來推斷特定細胞亞羣的富集情況。使用統計反褶積方法可以推斷出特定的細胞類型，該方法以前曾用於估計大塊組織RNA序列數據中的細胞類型比例。這種方法可以鑑定胰腺導管腺癌的三種癌細胞羣及其在腫瘤中的不同位置。
此後，利用多路錯魯熒光原位雜交(MERFISH)技術進一步擴展了RNA的成像，該技術能夠在單細胞水平上成像多達10,000種RNA。30 54個細胞RNA用編碼探針標記，編碼探針包含一個目標序列和兩個讀出序列，然後用讀出探針進行連續輪雜交和成像。因此，RNA在單分子水平上的表達可以定位在單個細胞的空間上。此外，利用La Manno等人改進的RNA速度方法，構建了細胞週期相的僞時間序列。最後，將scRNA-seq聯合MERFISH對小鼠下丘腦視前區進行研究。有了這些先進的工具，可以想象TME內腫瘤和免疫細胞的特徵、表型和定位可以更清楚地定義，從而更好地理解腫瘤進展機制和對治療的反應。
越來越多的測序技術被用來提高免疫蛋白質組分析的多路複用能力。例如，最近開發的抗體測序技術(Abseq)已經增加了單細胞蛋白圖譜的維度，甚至更大的程度，提供了理論上無限制的多路複用能力。Abseq使用DNA低核苷酸標記抗體，這些抗體通過液滴微流體條形碼和DNA測序技術在單細胞水平上被識別。Abseq具有10個鹼基的短標籤長度，提供了超過100萬個獨特的表位識別序列，並可以在理論上標記人類蛋白質組的每一個成員，檢測低表達如同每個細胞的單個抗體。作爲Abseq的擴展，另一種技術被稱爲通過測序的轉錄組和表位的細胞索引(CITE-Seq)，可以同時進行單個細胞的蛋白質組和轉錄組的無偏性、多路分析。通過寡核苷酸偶聯抗體(類似於Abseq)檢測到58個蛋白表位。在分裂成單細胞滴後，細胞裂解釋放細胞mRNA和結合到細胞表面表位的寡核苷酸，以便進行單獨的分析。這項技術提供了同時研究單個細胞內基因和蛋白表達的能力，將使研究人員瞭解細胞如何在不同的生物條件下調節其轉錄組和蛋白表型。這些技術目前只適用於表面蛋白標記物的檢測，這一侷限性可以通過RNA-seq技術的未來改進而克服。
在一個scRNA-Seq實驗中產生的大量數據也提供了豐富的信息，這些信息可以用不同的方式進行分析，允許研究人員從不同的角度進行調查。其中一個維度被稱爲僞時間分析，指的是根據細胞表達模式的相似性對其沿軌跡進行排序的計算模型。這些模型也被稱爲軌跡推斷(TI)方法，其運行假設是，單細胞數據是不同細胞在不同時間點沿着一個共同發育過程的連續過程的快照。60多種TI方法可用，Salens等人(2019)對此進行了綜述。這種分析可能有助於理解免疫細胞的發育是如何受到腫瘤進展的影響，反之亦然。例如，上面提到的Zheng等人的研究也對TME中的CD8+ T細胞進行了擬時間分析，將CD8細胞簇按照從初始、到效應、最後到衰竭表型的順序排列，證明了從激活到衰竭的過渡。
許多單細胞技術目前還處於起步階段：規程和技術仍在優化中。因此，在臨牀環境中對患者進行大規模篩查的成本可能過高而不可行。儘管如此，隨着這些技術的改進和商業化，提高效率和通量以及降低成本將使它們在未來可用於臨牀實驗室。
免疫治療的意義和結論
TME在分子和免疫學特徵上具有異質性和複雜性。 TME中的多種免疫亞羣和因素對免疫治療的結果和疾病預後有很大影響。如上所述，特異性免疫細胞類型的招募或積累極大地影響了免疫逃避與抗腫瘤活性之間的平衡，以及患者對治療的反應，進而影響TME的免疫應答。重要的是，這些細胞亞羣的變異，無論是在癌症類型內部還是在癌症類型之間，阻礙了對所有患者開發一種單一有效的治療方法。因此，癌症免疫療法的成功可能取決於能否根據患者的免疫狀況，爲每個患者量身定製個性化的治療療程。爲了實現這種個性化治療，有必要能夠捕獲每種癌症類型中TME的異質性，並對每種網絡如何交互和功能有一個機械性的理解。這些知識將有助於預測臨牀對治療的反應，以及爲患者設計更好的治療策略。在單細胞水平上進行深度免疫表型，並同時提取轉錄組、蛋白質組和空間信息的能力，使我們更接近設計更有效的個性化免疫治療的目標。
https://jeccr.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13046-020-01549-3
https://jeccr.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13046-018-0937-6