單細胞時代|| 單細胞代謝組學之免疫代謝

Immune metabolism in PD-1 blockade-based cancer immunotherapy
Immunometabolism in the Single-Cell Era
A novel strategy for single-cell metabolicanalysis highlights dynamic changes in immune subpopulations
Spatial metabolomics of in situ, host-microbe interactions

scRNAplus||一個通俗的解釋
單細胞時代 || 細胞身份概念的演變
單細胞時代 || 網絡分析應用進展,機遇與挑戰
單細胞時代 || 從衆病之王到希望之光
單細胞時代 || 宿主-微生物組相互作用

單細胞代謝組學指的是考察單個細胞的代謝水平。我們知道,活細胞無時不在與外界進行着物質和能量的交換,那麼,其代謝水平應是其生命體徵的主要表現。如果說單細胞轉錄組幫我們識別出細胞的身份,代謝組將反應細胞的即時狀態。單細胞代謝組學至少在通量和空代(空間代謝組)兩方面帶給我們新的見解。今天,我們跟着Immunometabolism in the Single-Cell Era來看看單細胞代謝組的進展與希望。

目前研究已經確定對免疫細胞的適當調節,可以促使我們理解其代謝途徑以及它們紊亂時如何導致免疫功能紊亂和疾病發展。然而由於技術上的限制,這種見解嚴重束縛於免疫細胞的體外激活,還是bulk水平的。但隨着單細胞應用的出現,研究人員現在可以估計臨牀樣本中單個免疫細胞的代謝狀態。在這裏,我們回顧這些單細胞技術和他們驗證免疫代謝的共同原則,同時也概述免疫細胞的代謝異質性。我們討論當前技術的侷限性以及未來的機會,以推動該領域發展,當然也希望該領域的發展能提高人類診斷和治療疾病的能力。

新陳代謝是所有生物過程的核心,它可以被廣泛地細分爲合成代謝過程(使用能量和構建塊進行生物合成)和分解代謝過程(爲合成代謝提供原料,併產生能量爲生物功能提供燃料)。除了這些功能,代謝酶和中間體有重要的調節作用,是主要的控制細胞行爲的小分子。最近在免疫代謝領域的研究表明,在健康和疾病中,代謝程序和它們所支持的特定免疫功能之間有着密切的聯繫。這些核心代謝功能的失調與許多現代疾病有關,包括癌症和慢性炎症性代謝疾病,如糖尿病、肥胖、動脈粥樣硬化和類風溼關節炎。然而,由於疾病的複雜性和所涉及的細胞表型甚多,對於發生在致病環境中的免疫代謝重塑的詳細瞭解還很缺乏。

營養水平的改變,氧氣可用性,信號因子的存在以及與鄰近細胞的相互干擾,都會誘導代謝變化,使細胞在其特定的組織微環境中發揮作用。由於每個細胞都生活在一個獨特的環境中,我們體內沒有一個細胞在新陳代謝、表型和功能上完全相同。在單細胞分辨率下,解決免疫代謝的時空異質性和闡明這一複雜性將推動免疫代謝領域向前發展,允許轉換到臨牀應用和理解體內免疫學的基礎。事實上,爲了充分理解細胞代謝調節免疫和疾病進展的機制,研究人員需要能夠解決免疫細胞代謝轉化爲效應表型的軌跡。可以說,單細胞圖譜技術具有解決上述所有問題的能力,即使在目前的發展狀態下也是如此。

從這個角度出發,我們將探討當前和新興的先進技術如何有助於我們理解免疫的代謝調節,並討論從bulk到單細胞免疫代謝譜分析的轉變。

常見的bulk代謝分析
  • 細胞外通量分析 (Extracellular flux analyzers)

細胞外通量分析儀,如海馬裝置(Seahorse apparatus),實時記錄細胞外酸化率(ECAR)和耗氧率(OCR)作爲代謝的關鍵讀數,並以此提供糖酵解和線粒體呼吸的間接測量。雖然使用特定的底物和抑制劑可以研究細胞對葡萄糖、谷氨醯胺或脂肪酸的相對偏好,但細胞外通量分析不能提供關於糖酵解和線粒體內TCA循環以外代謝途徑活性的詳細信息。事實上,這項技術允許簡單、快速地以96孔的方式對細胞進行分析,這極大地擴展了免疫代謝的研究視野。


應用該技術的發現包括炎性巨噬細胞的糖酵解開關和線粒體功能障礙,效應T細胞和活化的樹突狀細胞(DCs)的糖酵解增加以及T記憶細胞和il -4活化的巨噬細胞的線粒體呼吸增高。值得注意的是,ECAR是糖酵解的替代標記,培養基酸化不一定是糖酵解增強的結果。實際上線粒體呼吸二氧化碳的產生和/或細胞外TCA循環中間體(如琥珀酸鹽)的釋放也會使培養基酸化。這一侷限性可以通過對糖酵解途徑進行靶向代謝組學或通量組學來克服。

  • 穩態代謝組學

對於一個給定的時間點,代謝組學通過液相或氣相色譜-質譜(LC-MS或GC-MS)測量一系列代謝物的穩態水平。非靶向代謝組學測量生物樣本中的數百種代謝物,而靶向代謝組學則評估預先選擇的代謝物,併產生具有更高靈敏度的數據,並允許對代謝物濃度進行精確的絕對定量。除了測量小的代謝物,高分辨率MS-based profiling最近被應用在“shotgun”脂質體學中,分析不同活化的巨噬細胞的脂質體。大多數基於ms的方法仍然需要相對高水平的輸入通量(大約100,000s的細胞),然而最近的發展提供了一種以單細胞分辨率空間測量代謝物的方法。關於空間和單細胞代謝組學領域的最新發展的更深入的信息,我們參考了對主要新興方法的綜述,包括基質輔助激光解吸電離(MALDI)-質譜成像和二次離子質譜(SIMS)。將這種分析與本觀點中討論的單細胞方法相結合,必將有助於闡明在體內複雜組織微環境中單細胞水平的免疫代謝。

  • Fluxomics

通過給定途徑的通量改變不一定與該途徑內代謝組學測定的特定時間點的代謝產物水平直接相關。通過靶向質譜在連續時間點對底物和同位素同位素的測量,可以確定代謝通量和途徑動力學。代謝組學提供了某一特定時刻代謝物的“快照”,而13C/15N的標籤追蹤(或所謂的Fluxomics )可以被視爲一種“快照”。在單細胞分辨率方面,這種分析的使用仍處於起步階段,但在bulk方法中,如在Kibbey開發的質量同位素多序數光譜分析(MIMOSA fluxomics),羣落可以很容易地用於量化特定代謝反應的速率實驗室(Alves等,2015)。

關鍵的免疫代謝概念

下面對不同代謝途徑的描述爲本文後面討論的單細胞代謝譜分析方法中針對的不同代謝蛋白提供了最低限度的免疫代謝背景。關於免疫代謝的更多細節,我們參考了在不同的免疫細胞和疾病中關於這一主題的優秀和更全面的評論。

  • 糖酵解解析多種免疫效應功能

免疫激活是一個需要能量的過程,通常伴隨着糖酵解通量的增加。糖酵解開始於葡萄糖轉運體攝取葡萄糖(例如,GLUT1(在免疫細胞中占主導地位)和隨後在細胞質中加工產生丙酮酸,生成ATP,並在此過程中將NAD+還原爲NADH)。Elegant的研究強調了糖酵解酶己糖激酶1和2 (HK1和HK2)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、烯醇化酶和丙酮酸激酶同工酶M2 (PKM2)。爲了在沒有線粒體氧化磷酸化(OXPHOS)的情況下維持糖酵解通量,細胞可以通過乳酸脫氫酶將丙酮酸還原爲乳酸(LDH)回收NADH爲NAD+。

在Seahorse 分析中,當質子和糖酵解衍生的乳酸通過單羧酸轉運蛋白MCT1從細胞中輸出時,這種發酵反應可以被稱爲ECAR。而糖酵解在炎症免疫效應細胞中最爲顯著(Krawczyk等,2010;(Michalek等,2011),它對多種免疫激活模式至關重要,包括替代巨噬細胞激活和T調節性(Treg)細胞的誘導,而且糖酵解率在B淋巴細胞和T淋巴細胞之間存在差異。然而,在巨噬細胞促炎活化過程中,TCA週期通過下調IDH和SDH活性而被顯著重構(Jha et al., 2015)。後者是通過激活的髓細胞中ACOD1/IRG1特異性產生的免疫調節代謝物itaconate直接抑制而實現的。


  • 脂肪酸代謝影響免疫細胞表型和功能

脂肪酸氧化(FAO)是一種分解代謝途徑,將脂肪酸轉化爲乙酰輔酶a、NADH和FADH2等產物,用於線粒體產生能量。肉鹼棕櫚酰轉移酶1和2 (CPT1和CPT2)將長鏈脂肪酸穿梭到線粒體基質中,隨後通過羥酰基輔酶a氧化爲乙酰輔酶a圖1所示。免疫細胞亞型的關鍵代謝途徑(A)是調節免疫細胞重要的代謝途徑,包括最近單細胞分析方法中使用的代謝靶點。cpt1抑制劑依託莫西的濃度過高表明了這一點FAO在il -4誘導的巨噬細胞、記憶T細胞和treg中尤爲重要。然而,最近對CPT1和CPT2使用細胞特異性基因敲除的文獻報道,FAO在這些過程中很少。

與FAO相反,FAS是一種合成代謝途徑,將胞質乙酰輔酶a轉化爲脂質。乙酰輔酶a羧化酶(ACC)首先將乙酰輔酶a羧化爲丙二酰輔酶a,然後被脂肪酸合酶(FASN)拉長。FAS支持效應T細胞的增殖,是配置巨噬細胞炎症信號的質膜的關鍵,也是內質網合成使活化的DCs分泌細胞因子的關鍵。

  • 不同的免疫細胞有着不同的氨基酸代謝途徑

T細胞的免疫激活與氨基酸代謝需求的增加有關,例如l型氨基酸轉運蛋白1 (LAT1、CD98和SLC7A5)的重要性以及TCR參與後成功信號轉導的絲氨酸途徑。此外,氨基酸在調節免疫反應的特定方向方面發揮作用。例如,兩個Th1和Th17細胞通過轉運蛋白ASCT2增加谷氨醯胺用量,以應對抗原受體的刺激,而抗炎treg不受谷氨醯胺供應改變的影響。谷氨醯胺酶(GLS)將谷氨醯胺轉化爲穀氨酸爲TCA循環提供燃料,該途徑促進Th17分化,同時降低Th1和細胞毒性T淋巴細胞分化。

在巨噬細胞中,氨基酸也發揮着重要的功能和調節作用。谷氨醯胺代謝與抗炎極化程序有關,絲氨酸代謝與IL-1b的產生調節有關。此外,氨基酸還可用於巨噬細胞產生效應分子。LPS(+IFNg)誘導的巨噬細胞主要通過誘導NO合成酶(iNOS)將精氨酸轉化爲一氧化氮(NO),而il -4誘導的巨噬細胞主要將精氨酸代謝爲鳥氨酸和多胺。要了解更多關於氨基酸如何調節免疫的信息,我們參考了最近關於這個主題的一篇優秀的綜述(Kelly和Pearce, 2020)。

重要的是,迄今爲止所描述的大多數概念都是從體外培養和激活的免疫細胞的bulk測量中得出的。如下所述,技術上的限制很大程度上阻礙了現行方法在體內的驗證。接下來,我們描述瞭解決這些關鍵問題的單細胞方法,以推動免疫代謝領域到下一個水平。

當前方法的侷限性
  • 需要從體外到體內驗證

鑑於環境因素的重要性,實驗室細胞培養的免疫細胞代謝明顯不同於體內細胞培養。事實上,Ma等人最近在小鼠中使用13c -葡萄糖輸注的方法研究了CD8+ T細胞對李斯特菌感染的代謝,並觀察到體內活化T細胞的代謝情況有根本不同。在vito激活的T細胞中,CD8+ T細胞從OXPHOS向糖酵解轉變,而在體內激活的CD8+ T細胞顯示更高的氧化代謝率和依賴葡萄糖依賴性絲氨酸的生物合成。這項工作中開發的方法需要精細的實驗操作,而且不容易擴展或適用於人類樣本。由於動物模型有其自身的侷限性,而且並不總是能夠複製人類免疫學和生物學特徵,因此這種在人體環境中的轉換是很重要的。

一般來說,利用這些和其他技術進一步發展體內(或體外)細胞代謝評估在該領域具有先導作用。同時,體內免疫代謝研究的關鍵概念的驗證,特別是在人體內需要代謝譜的替代選擇。

  • 免疫代謝的時空特徵

免疫細胞非常依賴營養物質的及時供應,而營養物質的及時供應取決於細胞在腫瘤或炎症部位微環境中的位置。分類和bulk測量不可避免地抹平了細胞種羣的分佈差異,這掩蓋了時間和環境的影響。因此,瞭解細胞在單細胞分辨率下的代謝狀態,可以解釋其在體內複雜組織微環境中表型異質性的分子機制。這可能有助於理解它們功能背後的原因,或者它們在病理環境下無法正常工作的原因。大多數最新的轉錄和成像技術可以解決單個細胞甚至代謝物的空間排列問題,它們的進一步發展將對進一步理解人類樣本和體內環境中的免疫代謝重構至關重要。

時間是免疫代謝領域經常被忽視的另一個方面。我們知道,大多數免疫細胞在激活後糖酵解迅速增加,這最終導致代謝通量增加,並在其效應狀態下大量特定代謝物(通常在24小時後)。然而,這是如何隨着時間的推移發生的,它是如何支持效應表型的獲得和疾病的發展的?這些問題都還沒有具體的答案。解決免疫細胞通過代謝轉化爲效應表型的動力學問題,對於確定哪些事件是原因,哪些事件是果至關重要。總之,理解免疫代謝的時空異質性不僅將徹底改變我們的基礎生物學知識,而且也有助於合理設計新的治療方法。

  • 通量的限制

免疫代謝研究中,常用分析技術(bulk)的侷限性至少可以部分地解釋我們面臨的在體外到體內的轉化和從老鼠到人的驗證的困難。代謝組學和細胞外通量分析的一個主要警告是需要相對高的細胞數量,而這在人類臨牀樣本中通常不存在。例如,Seahorse XF分析儀測量每孔中數萬到數十萬個細胞的細胞外通量,通常需要4-5個複製孔。對於代謝組學,研究人員通常測量每個複製的50萬個混合細胞,即使有這麼高的輸入,代謝的覆蓋範圍也是有限的,因爲我們通常測量細胞中估計存在的數千個代謝物中的幾百個。細胞外通量分析和傳統代謝組學的另一個缺點是,它們評估的代謝特徵不是很穩定。因此,獲得的結果可以受到長時間和苛刻的組織消化和熒光激活的細胞分選儀的影響。因此,需要新的代謝譜分析方法以及新的、優化的細胞分離方法來測量體外少量免疫細胞的穩定代謝特徵。

間接評估細胞代謝水平

代謝組學與其他“在處理過程中更穩定的組學數據(如轉錄組學和蛋白質組學)”相結合,至少可以部分克服代謝物水平的不穩定性。代謝通量可以看作是代謝物水平和代謝它們的酶的存在和活性的結果。基因表達分析和蛋白質組學已經可以爲代謝途徑的調控提供一些見解,但當與代謝組學數據整合時,就變得特別強大。利用網絡整合的方法,Jha等人確定了TCA週期中支持炎症巨噬細胞反應的一個重要代謝停滯。Baardman等人也結合代謝組學和轉錄組學數據證明含脂巨噬細胞中,PPP與炎症反應的降低有關。同樣,蛋白組學和代謝組學的整合揭示了T細胞活化的代謝需求。這些獨特的“組學”方法,特別是當整合時,可以揭示調節代謝樞紐,可以使用基因工具或藥理學化合物進行功能分析。

目前單細胞代謝組學的大規模應用還爲時過早,因此免疫代謝研究進入單細胞時代需要替代方法。先前使用bulk轉錄組學和蛋白質組學描述細胞代謝的成功表明,使用相關的單細胞組學方法是目前的發展方向。爲此,最新的單細胞RNA測序(scRNA-seq)和基於細胞的方法在單細胞分辨率繪製代謝景觀將在本文的下一部分討論。

基於單細胞轉錄組分析細胞代謝

隨着scRNA-seq的出現,人們可以在複雜的多細胞生態系統中解析單個細胞的轉錄譜,這在免疫學中是非常重要的。如今使用 10x Genomics,scRNA-seq實驗每樣本多達1萬個細胞,常規檢測每個細胞2到4千個基因。即使在免疫學背景下直接檢查scRNA-seq數據,也可以很好地說明發生在體內的關鍵代謝過程。例如,我們可以使用免疫檢查點封鎖抗體(ICB)、抗pd -1/抗ctla -4抗體或對照抗體。在本系統中,ICB治療導致腫瘤排斥反應,與免疫室的整體激活和髓系室內活化細胞的出現。如圖2A和2B所示,我們創建了這個scRNA-seq數據集的可視化信息,以演示免疫細胞亞羣中一些關鍵代謝基因的行爲,值得注意的是:

  • 與糖酵解活性增加相關的基因像Glut1在ICB處理後的活化巨噬細胞中富集。
  • Nos2是炎症巨噬細胞活化的代謝基因,在ICB治療條件下特異性的巨噬細胞中富集。
  • Phgdh的表達與Mki67高增殖T細胞的表達相關,這與描述絲氨酸代謝在T細胞增殖中的作用的體內外bulk分析一致。
  • NRF2轉錄本(Nfe2l2)是氧化應激反應的關鍵因素,相對於T細胞,巨噬細胞中NRF2轉錄本(Nfe2l2)的水平通常富集,且似乎不依賴於治療條件。然而,其直接靶點如Hmox1在炎性巨噬細胞亞羣中確實增加,這與NO和itaconate潛在的氧化/親電應激相一致。總之,這與NRF2主要在蛋白水平上受到調控的事實一致(Taguchi等人,2011),並強調了對這一關鍵的代謝調節因子,需要分析蛋白而不是基因表達。

直接檢測scRNA-seq數據中特定關鍵代謝基因的類似方法被證明在描述果蠅眼睛發育過程中細胞凋亡的代謝方面是有效的。總之,這些例子說明了在研究新陳代謝方面scRNA-seq數據的潛在用途。然而,在單細胞分辨率下全面繪製代謝全景的方法仍然相對缺乏,並且/或處於發展的早期階段。大多數對scRNA-seq數據進行代謝分析的方法來自bulk
RNAseq分析技術,在進行這一轉變時必須克服相當大的挑戰。

事實上,bulk的轉錄分析提供了一個吸引人的數據,因爲它產生關於轉錄水平在序列細胞內的詳盡信息。因此,沒有信號通常意味着沒有相應的轉錄。這與代謝組學分析相反,在代謝組學分析中,由於技術限制,而不是由於代謝物本身的缺乏,覆蓋範圍有限,信號缺失經常出現。然而,這種轉錄譜分析的優勢在scRNA-seq數據中並不明顯。由於通常較低的測序深度和drop-out事件,個別基因在某些細胞中的表達水平可能出現零,即使這些基因實際上是表達的。典型的測序深度是每個細胞25000 - 50000個讀值,這樣每個細胞就能準確地檢測到3000 - 4000個基因。淺測序(即每個細胞1000個基因的順序)可能會檢測到大多數常見基因和家養基因,而只有很少的亞種羣特異性基因,這將導致在將數據與其他已發表的簽名進行比較時出現重大困難。然而,即使每個細胞檢測到3000 - 4000個基因,也遠遠低於估計的12000 。根據bulk RNA-seq數據,15000個基因在純化細胞羣中表達。在這些情況下,技術,如數據估計必須用於後處理數據和獲得平滑的轉錄概況。例如,與T細胞或巨噬細胞相比,中性粒細胞中通常檢測到較少的總轉錄本。因此,在比較不同細胞間的途徑時需要謹慎,因爲某些簇的覆蓋率較低可能導致假陰性結果。大多數用於scRNA-seq數據的代謝分析方法可以大致分爲兩大類,簡要描述如下:

  • (1)基於通路富集的分析
  • (2)基於通量平衡分析(Flux Balance Analysis,FBA)的方法。
  • 基於通路富集的分析

構成不同代謝途徑的基因被很好地註釋(Kanehisa和Goto, 2000),並且可以使用標準的生物信息學途徑富集技術直接對基因集進行研究。這種簡單而強大的方法可以揭示新的生物學洞見。例如,根據對已發表的大量RNA-seq數據中該通路轉錄富集的初步觀察,研究了T細胞中絲氨酸代謝的作用。如圖2所示,在scRNA-seq數據中,該通路在增殖的T細胞簇中富集。最近,Xiao等人展示瞭如何調整途徑富集管道進行scRNA-seq數據分析,並利用其表徵腫瘤微環境內的代謝多樣性。使用類似的分析策略,Miragaia等人(2019)強調了在不同組織中treg的代謝異質。

  • Flux Balance Analysis-Based Approaches

FBA是一種計算系統中代謝通量穩態分佈的優雅方法,該系統將滿足給定網絡結構的輸入和輸出通量的約束。簡單地說,FBA將細胞內的代謝佈線視爲一個輸入輸出水龍頭數量有限的管道系統,要求系統的每個節點都建立穩態平衡。換句話說,進入每個反應的代謝流量應該等於離開那個反應的代謝流量。因此,單個酶的特異性表達水平並不直接參與建模,透視圖的結果主要依賴於網絡拓撲結構和模型的輸入和輸出。輸入通常是最常見的底物攝取反應(例如,葡萄糖,谷氨醯胺),輸出(通常稱爲目標函數)與被研究的特定細胞行爲相關。例如,一個目標可以是最大限度的生產生物量生長細胞或生產某些代謝物,如
活化巨噬細胞的NO。

基於fba的方法的一個重要優勢是,它們依賴於網絡分析,而不與預先定義的通路知識相關聯,因此可以揭示新的生物學概念。因此,它提供了一個強大的工具,以瞭解隨着網絡拓撲結構的變化而發生的代謝通量變化,例如,由於基因敲除或組織特異性表達模式。事實上,Zhang等人已經演示了使用fba-base方法對不同組織中的NAD+生物合成進行基於scrna -seq的分析。從概念上講,這項工作遵循了基於來自不同組織的bulk RNA-seq數據研究組織特異性代謝的方法。除了觀察明顯不同的網絡拓撲,FBA框架允許研究在相同網絡內的代謝重塑,但在刺激誘導所需細胞輸出量變化的基礎上。這是可行的,當至少一些關鍵的代謝特徵是已知的時候。此前,大量數據採用這種方法揭示了itaconate作爲SDH抑制劑的作用(Lampropoulou等,2016)。最近,該方法被引入到scRNA-seq數據中,以研究致病性/非致病性Th17細胞的代謝差異,以及與Tregs的差異。

需要注意的是,當前方法通常關注兩種不同細胞羣之間的差異。在這些情況下,更直接的方法是簡單地執行兩個種羣之間的差異表達分析,並執行通路富集分析或代謝子網絡分析。我們認爲,這是至關重要的,過去的一對一比較已知細胞類型,並學習捕獲整個數據集內的代謝多樣性。因此,下一代代謝scRNAseq分析方法有望揭示獨立於細胞身份分配的主要代謝變異。雖然目前在所有代謝基因的空間中簡單地進行這種聚類或使用註釋的代謝途徑作爲主要成分是可行的,但最強大的聚類方法將在沒有單個途徑先驗知識的情況下結合基於網絡的分析依然是困難的。 這將允許將單個細胞作爲不同的代謝實體,並將從新陳代謝的角度提供對整個細胞生態系統的不偏不倚的觀點。

基於蛋白質的單細胞代謝分析
  • 利用Mass - Cytometry分析單細胞代謝

單個細胞內蛋白質仍處在起步階段(Slavov, 2020),尚未應用於immunometabolism研究,最近的文獻展示了使用大規模血細胞計數(飛cytometry by time of flight,CyTOF)估計單個細胞內酶的代謝。這種技術允許同時量化1- 40個參數在單細胞分辨率下。在免疫代謝的背景下,應該考慮包括針對主要代謝的抗體。不出意料,由三個不同的研究小組獨立設計的代謝小組顯示出相當大的重複。


爲了設計免疫代謝細胞板,Hartmann等首先篩選了超過100個商業抗體針對廣泛的代謝因素,並選擇了41個代謝抗體,通過所有生物控制,並在人類白細胞的概念驗證研究中產生了穩健的可重複的結果。根據譜系標記表達模式識別出不同的免疫細胞亞羣后,無需預先分類就可以估計和比較所有免疫細胞亞羣的代謝狀態。通過mass cytometry獲得的代謝狀態圖譜與它們在特異性免疫功能中所描述的角色一致,例如漿細胞樣dc中與葡萄糖和脂肪酸代謝相關的靶點高表達,以及中性粒細胞中高水平的限制率的PPP酶G6PD。此外,哈特曼等人已經證明了海馬測量的T細胞代謝變化與單細胞蛋白水平上觀察到的變化之間高度一致。這強調了基於細胞的單細胞代謝譜是一個強大的工具。

  • CyTOF在臨牀中的應用(代謝方向)

Hartmann等人(2020)通過比較結直腸癌患者的腫瘤和健康鄰近組織,以及健康供體外周血單核細胞和淋巴結,發現了富含腫瘤相關CD8+ T細胞的特定代謝表型。這些細胞表現出大的中性氨基酸轉運蛋白1 (LAT1,CD98)和多種酶在不同代謝途徑上的表達降低。這些所謂的metalow細胞表現出明顯的T細胞衰竭跡象,包括PD1和CD39表達增加,線粒體容量減少,TCF1水平低。值得注意的是,一小部分metalow亞羣不表達PD1或CD39,這表明結合代謝和免疫細胞標記提供了額外的維度,在表型和功能上定義與人類疾病相關的腫瘤相關免疫細胞。

  • 使用基於細胞的代謝譜的動物模型研究

除了人體樣本,代謝細胞板也可以用於解剖動物體內的代謝重塑。Levine等人利用單核增生李斯特菌感染期間T細胞反應的基於細胞的代謝譜作爲CD8 T細胞分化的良好模型。這裏主要是基於早期的bulk代謝和之前的文獻,因此,獲得的mass cytometry數據很好地概括了該領域的概念。事實上,效應T細胞顯示了預期的糖酵解活性的增加(Michalek)
CyTOF分析中GLUT1和GAPDH的誘導也證明了這一點,海馬分析中增加的ECAR同樣證實了這一點。相反,記憶T細胞表現出CPT1a的誘導,CPT1a在FAO中起關鍵作用,之前認爲與CD8記憶T細胞相關。這種代謝重組是以一種循序漸進的方式發生的,可以在單細胞分辨率下隨時間推移而進行。這種代謝變化包括激活後早期的均勻糖酵解轉換,激活2天后GAPDH的異質表達。這兩個GAPDH羣體表現出功能上的差異,這在bulk的方法中是無法發現的。

此外,該方法還發現了一個過渡的效應T細胞池,僅使用針對譜系標記和T細胞亞羣的普通抗體無法檢測到。這個新發現的亞羣在感染後4天出現,具有高度增殖能力,糖酵解和線粒體氧化標記物均被強烈誘導表達,並分別受到CTP1a和CD98表達的脂肪酸和氨基酸的刺激。通過CyTOF檢測到這一未知的過渡細胞子集後,作者接下來將這些細胞分類爲CD62Llo CD44hi CD25hi,通過胞外通量分析證實其糖酵解和氧化代謝的增加。這是一個很好的例子,說明單細胞技術如何提供新的見解以及如何利用已建立的bilk分析來驗證這些新發現。

  • Met-Flow:通過Flow進行單細胞代謝分析

使用熒光標記的抗體代替重金屬偶聯抗體,“常規”流式細胞術也可以進行單細胞代謝分析(有一些優點和缺點;見後)。基於流式細胞術的方法稱爲Met-Flow,使用10個氟鉻偶聯抗體靶向不同代謝途徑中的限速酶和關鍵蛋白,結合表型標記生成27色流式細胞術面panel,以查詢免疫細胞的代謝狀態。作者使用了BD公司的X30 FACSymphony流式細胞儀。利用10個代謝標記的表達譜,Ahl等人可以聚類和分離血液白細胞亞羣到不同的代謝。類似於Hartmann等人的CyTOF分析,CD4+和CD8+T細胞亞羣不能單獨在代謝蛋白上分離,但大多數其他免疫細胞亞羣都能非常有效地單獨基於它們的代謝概況來定義。這表明,使用與特異性免疫效應功能相結合的關鍵代謝酶抗體來擴展傳統的流式細胞儀面板可能更有益,而不是染色額外的免疫細胞表面標記,因爲其實際功能通常未知。即使使用相對較小的細胞檢測面板,包括一些代謝性抗體,進一步解剖免疫細胞的表型、功能和代謝,使用幾乎在每個研究所都存在的設備,也可能是非常有用的。這也支持了波茲南斯基和阿什卡爾的觀點,他們之前提出的問題:

‘If an NK Cell Cannot be Defined by How It Looks, Could
It be Defined by How It Is Fueled

獨特的代謝指紋,而不是表型,表徵NK細胞的功能命運:

值得注意的是,Met-Flow僅用10種代謝蛋白鑑定了血液白細胞亞羣,其分辨率與
+500個基因的scRNA-seq分析相當,而單獨分析相同的10個基因的表達不能解決免疫人羣。此外,Met-Flow證實了在T細胞激活時糖酵解、OXPHOS和FAS的上調,並且這種代謝重組被大量細胞外通量分析證實。後續的單細胞Met-Flow分析表明,大多數細胞依賴葡萄糖來進行代謝轉換,但也發現有一部分CD4中央記憶細胞使用替代代謝途徑。因此,單細胞(而bulk)的代謝譜能夠識別單個T細胞亞羣的特定代謝特徵和需求。

單細胞代謝組技術的優點和缺點
  • 單細胞轉錄組與Cytometry

單細胞轉錄組學和多顏色細胞計數術在獲取信息和建立分析所需的實驗裝置方面是互補的方法。因此,它們可以同時用於獲得最大的分辨率,但同時,任何一種方法都可以更容易獲得或提供更多信息。在這裏,我們描述了選擇最優方法的一些基本考慮事項。


單細胞轉錄組通常每個細胞捕獲3000-5000個基因。這允許無偏見的聚類數據和潛在的識別新的亞種羣。從新陳代謝的角度來看,它允許跨許多途徑同時檢測多個基因,因此產生新陳代謝變化的全局圖。另一方面,cytometry 一次只能做0-40個蛋白,因此,利用流式細胞術方法設計抗體panel需要合理的設計。

與此同時,兩種方法所描繪的典型細胞數量是非常不同的,因爲目前scRNA-seq每個樣本只能處理約10,000個細胞,而流式細胞術可以常規處理數百萬個細胞,如果需要,可以隨時擴大規模。當需要考慮先天淋巴樣細胞或樹突狀細胞等少數細胞羣時,這種區別就變得至關重要。此外,單細胞轉錄分析的成本幾乎是一個數量級的流式細胞術運行,因此,它是不可行的分析大量的複製或增加統計能力的分析,從相同的樣本。此外,與流式細胞術相比,scRNA-seq對細胞形態更敏感。由於細胞形狀和儀器設計的不兼容性,許多細胞類型,如肌細胞或神經元,不能被可靠地描繪。在其他情況下,如中性粒細胞,轉錄譜是複雜的脆弱的細胞和整體較低的RNA含量的細胞,這引入了顯著的偏差。

另一方面,轉錄譜的一個顯著優勢是基於利用單核RNA-seq。在這種方法中,我們可以分離單個細胞核並描繪相應的轉錄。這種方法有幾個重要的優點,儘管由於大多數RNA定位於細胞質而不是細胞核,檢測到的轉錄本數量通常要少得多。首先,這種方法避免了形態學影響。但最重要的是,這種方法允許對冷凍樣本進行定性分析,包括那些多年前已經進行過生物標記的樣本。這開啓了從臨牀樣本中研究組織羣的能力,而這些臨牀樣本通常需要長時間收集。

儘管有這些優勢,轉錄數據只提供了代謝測量的“兩次移除”代理,在這方面,細胞檢測是一個更直接的方法,產生蛋白質水平的測量。基於抗體的方法直接測量酶的水平,包括它們的翻譯後修飾(及其關鍵調節因子的修飾)。使用基於細胞的方法的另一個好處是,它允許包含非基於蛋白的細胞表型標記。例如,通過包括標記的IdU、BrU和嘌呤黴素底物,代謝譜和細胞表型可以功能性地連接到合成代謝過程,如DNA、RNA和蛋白質合成。

總之,在受控實驗設計的背景下,我們將提倡一種組合方法,其中scRNA-seq在有限的規模上運行以探索變化的廣闊前景,然後使用假設驅動的抗體panle進行大規模的細胞分析以在蛋白水平上進行驗證。

  • Cytometry 與流式細胞術比較

流式細胞術仍是最常用的免疫細胞圖譜分析方法,但由於熒光技術的存在,可同時檢測的參數數量相對有限溢出。當一種氟鉻的熒光發射被另一種氟鉻的探測器探測到時,就會發生這種情況。因此,流式細胞儀數據需要仔細補償,這對大的面板尤其具有挑戰性。
然而,在流式細胞術中使用的顏色和抗體的數量正在快速增長,20個或更多的標記板現在很常見。到目前爲止,它還沒有達到細胞of中可評估的+40參數,但在這一點上,流式細胞術正在迎頭趕上。與熒光檢測器不同的是,CyTOF使用mass cytometer來檢測每一種金屬的TOF,而TOF是由其質量決定的(Spitzer和Nolan, 2016)。因此,檢測重疊和背景(流式細胞術中的自體熒光)在細胞分析中都很低,因爲重金屬不會自然地出現在細胞中。設計理想的面板細胞仍然是減少由於金屬標籤的雜質造成的“溢出”,並考慮不同金屬信號強度的差異的關鍵。此外,在流式細胞術中,細胞中沒有質量通道與PE等亮熒光色一樣敏感。流式細胞術需要快速獲取染色細胞以防止光漂白,而金屬標記的樣本可以(cryo)保存數週,並在臨牀試驗過程中,當所有樣本隨時間採集時同時獲得。或者,細胞可以被分離、固定、儲存一段時間,並在臨牀試驗或實驗完成後一起處理。事實上,可以對多達20個樣品進行獨特的條形碼編碼,使我們能夠將它們組合起來,然後染色、處理,並作爲一個多路複用的樣品獲得它們。這些優勢帶來了成本,因爲CyTOF抗體比熒光偶聯抗體更昂貴,而且用於獲取標記細胞的儀器在大規模細胞術中更昂貴和先進。雖然多色流式細胞儀幾乎是每個實驗室的主要設備,但大規模流式細胞儀卻不那麼常見,而且僅限於高端核心設備。

如今,光譜分析儀正在推動流式細胞術的發展。使用5個激光器探測64個通道的全部發射光譜,像Cytek aurora這樣的儀器現在能夠以一種靈敏、快速和可接受的方式探測30多種顏色。這對於(免疫)代謝研究特別有價值,因爲它可以將針對代謝蛋白和mune譜系標記的氟鉻標記抗體與熒光代謝工具結合,以提供額外的代謝信息。例如,葡萄糖轉運體glut1的表達可以直接與熒光標記2NBDG的攝取相關。類似地,提示線粒體氧化增加的蛋白表達增加可以直接與線粒體質量和膜電位相關(見表2)。該技術的優點和缺點強力流汗細胞外通量分析(間接)功能reads細胞數目和複製需要儀器的可用性限制糖酵解和線粒體呼吸負擔得起和快速受到細胞分離和分類代謝組學的影響。因此,基於熒光的流式細胞術的一個明顯優勢是熒光代謝染料的適用性,而大規模細胞術的最大優勢是細胞板的大小、信號的穩定性和條形碼的可能性,允許在臨牀試驗中獲得免疫細胞住院活檢的深入的單細胞代謝分析。

免疫代謝的空間解決方案

目前列出的所有方法的一個主要缺點是它們需要懸浮的細胞,因此缺乏空間信息。空間方面是特別重要的,因爲特定的微環境因素,包括複雜的混合刺激,營養物質的可用性和與鄰近細胞的相互作用,是關鍵的驅動細胞代謝概況在組織和決定性的形狀免疫和疾病進展。傳統的單細胞分析方法的另一個缺點是,用於將組織分解成單細胞的特定協議會導致一些細胞死亡,但不是所有細胞,並且可能有利於與相關代謝分離特定的免疫細胞亞羣。綜上所述,這些侷限性強調了將細胞在組織微環境中的免疫代謝特徵的關鍵觀察值進行驗證的必要性,並考慮到細胞的空間組織,避免細胞分選相關的問題。即時捕獲空間環境和單細胞轉錄組譜的新方法正在被應用,但它們在免疫代謝研究中的應用還沒有被描述。然而,最近的出版物強調了如何在蛋白質水平上以一種高度複雜的方式評估單細胞在其微環境中的代謝構型。

  • MIBI-TOF作爲基於蛋白質的空間單細胞免疫/代謝分析

Hartmann等人通過將他們建立的代謝細胞面板轉移到多路複用離子束成像(MIBI-TOF)平臺,在空間代謝分析方面邁出了重要一步。這種最近發展起來的方法將單細胞代謝pro-files、免疫細胞表型和功能狀態與細胞間的相互作用和組織內的位置結合起來。爲此,組織切片用重金屬偶聯抗體(也用於Cy-TOF)染色,然後用離子束掃描,從識別特定代謝和免疫靶點的抗體中釋放重金屬。對於每個獲得的像素點,釋放的離子通過TOF-MS進行量化,就像在CyTOF中一樣,重要的優點是mibi - tof獲得的高維數據也包含空間信息。

染色結直腸癌和控制組織部分細胞系標記結合廣泛的metabolicantibodies,緊隨其後的是單個細胞的分割取得圖像和隨後的細胞到細胞系集羣,允許研究人員一些免疫細胞phenotypesto代謝特徵,是由其特定組織微環境。代謝概況空間組織在具有相似代謝特徵的環境中,而與細胞類型無關。細胞表達與糖酵解、線粒體呼吸或氨基酸代謝相關的高水平代謝因子,經常被表達相同代謝目標的鄰近細胞所包圍。這種微環境驅動的代謝極化在比較靠近腫瘤邊界的細胞和遠離邊界的細胞的免疫代謝譜時尤爲明顯。典型的是,代謝抑制細胞離腫瘤邊緣較遠,而代謝活性細胞則位於腫瘤免疫邊緣。由於mibi - tof方法可以對從生物銀行獲得的現有FFPE材料進行,它提供了將免疫代謝特徵和位置與臨牀結果和標緻治療成功聯繫起來的機會。因此,單細胞代謝譜是將免疫代謝研究轉化爲病房臨牀診斷和治療的重要一步。然而,應該指出的是,特定酶的存在並不總是與其活性相關的,當從這些基於抗體的研究中得出結論時,應該考慮到這一點。

  • 利用脫氫酶活性測定在微環境中繪製代謝圖譜

Miller等人先前配置了一種替代方法來評估細胞在其組織微環境中的代謝配置。他們的方法依賴於飽和底物和輔助因子利用率的酶活性測量,並結合連續組織切片的多種免疫細胞馬克森染色。測定了催化主要元bolic途徑的五種酶的脫氫酶活性:PPP中的G6PD,糖酵解中的GAPDH,乳酸不乳酸發酵中的LDH,以及TCA循環中的IDH和SDH。當這些脫氫酶被激活時,硝基藍四唑氯(NBT)被NAD(P)H還原爲一種強烈的彩色狀態,這種狀態可以被量化,並與連續切片上獲得的免疫細胞標記表達相關。作者利用這一技術研究了人類癌性和對照性結腸中巨噬體和T細胞亞羣的代謝特徵。與TME內的非炎性巨噬細胞相比,腫瘤內產生IL-6和TNF的巨噬細胞顯示糖酵解GADPH活性增加,但與健康組織中的巨噬細胞相比,總體腫瘤相關巨噬細胞出現代謝抑制。因此,人們很容易推測,巨噬菌在腫瘤中的代謝適應能力受損可能會阻止它們的抗腫瘤活性。此外,在健康組織中,與Tregs相比,Tregs表現出癌症特異性代謝特徵,糖酵解GAPDH活性受到抑制,線粒體SDH升高。識別免疫細胞亞羣的這種腫瘤特異性代謝特性可以幫助開發新的治療方法。值得注意的是,這些不同脫氫酶的活性是在飽和底物濃度下測量的,因此是對最佳脫氫酶活性的估計,而不是在特定環境下(如細胞競爭營養物質的缺氧環境)對其活性的精確反映。

結論與未來方向

很明顯,理解單細胞水平上的免疫代謝的技術轉變是不可避免的,儘管還沒有完成。在單細胞分辨率下的轉錄組和蛋白質組分析顯示了建立當前免疫代謝領域前沿的成熟水平,即對臨牀樣本和炎症反應中的代謝景觀進行初始評估和集中探測。如上所述,特定的代謝特徵可以通過scRNA-seq分析或混合細胞培養/體外活體擴增的體積觀察得知,然後通過專門的蛋白質靶向板進行解剖。例如,基於最近於面板之間的重疊和以前的文學,可以編譯coremetabolic面板組成的10代謝抗體,也適用於多色流式細胞術和一組更exten-sive面板包括一個額外的10個抗體gainmore詳細通過CyTOF分析和功能信息。

儘管諸如CyTOF和scRNA-seq等方法對於不同細胞亞羣內的代謝重構具有重要意義,但這些方法獲得的原始數據仍然是間接的或有限的。因此,能夠解決這些挑戰的技術進步將爲下一代免疫代謝研究奠定基礎。兩個關鍵的方向是:
(1)提高單細胞數據的深度和質量
(2)提高我們解決代謝特徵空間分佈的能力(例如,在組織切片內)。

下一代方法將包括直接單細胞代謝物分析(Duncan et al., 2019),這將伴隨着穩健方法的發展,以分離單個細胞,而不受顯著的代謝干擾(圖3)。這種方法不僅可以直接評估代謝物水平,而且還可以在單細胞水平上提供通量組學,當細胞混合物,甚至動物和人,被標記的底物支持時。考慮到代謝物的不穩定性以及細胞分離會影響讀數的事實,單細胞代謝組學的未來很可能不是在懸浮分離細胞中測量代謝物,而是在基於ms的成像方法中在其組織微環境中空間解決單細胞的代謝配置。要了解諸如用於單細胞甚至亞細胞分析的MALDI-MS等新興技術的詳細信息,我們請讀者參閱最近的優秀評論。

以單細胞分辨率解決免疫代謝當然不是終末階段,因爲細胞不均勻,而是高度分區的結構,具有不同功能的代謝物在不同亞細胞位置的異質分佈。例如,乙酰輔酶a促進線粒體內的三羧酸循環,同時促進細胞核內細胞質和組蛋白乙酰化中的脂肪酸和膽固醇生物合成。因此,改善代謝讀數的亞細胞表達將爲免疫代謝領域和遺傳學領域的科學提供額外的一層視野。在互補組學分析的背景下,沿着CITE-seq方法實現的路線進行的蛋白融合和轉錄組水平測量在免疫自代謝領域具有重大前景。特別的是,擴展基於cite序列的方法,用於細胞內蛋白質的粗獷測量,將允許測量大量的酶和它們的轉運後修飾,因爲抗體與核酸條形碼結合,因此100-200個蛋白質可以同時測量。這將大大提高分辨率比目前0-40 抗體可能帶有CyTOF,尤其是考慮到幾乎一半的面板都是典型的細胞類型特異性標記。

此外,採用新的數據生成技術將需要開發一系列新的計算應用程序,這些應用程序可以將基於網絡的數據與相應的技術輸出集成在空間分配或免疫反應的潛在時間方面。利用諸如SCORPIUS這樣的計算算法,有希望推斷出僞時間序列,以研究代謝重組的假定時間序列。理解表型、功能和代謝變化的動力學可以揭示哪些代謝事件是因果關係,哪些只是特定免疫狀態的旁觀者。理解代謝的時空方面可以幫助合理地設計新的治療方法,因爲人們將有一個更好的理解疾病的驅動因素和旁觀者效應。特別是,靶向代謝變化,這些變化在運動前可能也調錶型改變,在免疫細胞可以改善免疫細胞功能和疾病的結果。此外,生理免疫反應發生在空間上高度組織化的多分子環境中。鑑於我們目前對免疫代謝調節的理解是通過高度可控的蛋白玻璃環境(通常是純化細胞類型)獲得的,針對vivo phenotypes的代謝干預設計既依賴於已知的考慮因素,也同樣依賴於偶然。

我們設想,理解多細胞免疫代謝重構的基本原理,將爲從關鍵的細胞內通路的干擾演繹過渡到成功的全身範圍的異常反應鋪平道路。但很明顯,我們需要額外的分析工具來全面掌握免疫代謝的時空方面,以及在單細胞水平上進行代謝聚類等任務。

總之,免疫代謝正在迅速成爲一個系統水平的科學,其中需要多學科專家充分利用新技術。因此,爲了成功地過渡到單細胞免疫代謝時代,計算技術的進步不僅在數據分析本身方面,而且在實驗免疫學家的可用性和可交互性方面都很重要。


https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-analyzers

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