這篇文章簡單記錄一下qPCR的原理以及它在新型冠狀病毒檢測中的應用，分享給身邊好奇核酸檢測的朋友，參考視頻鏈接：https://www.bilibili.com/video/BV1454y1Q7U2/?spm_id_from=333.788.videocard.0
1. 熒光定量PCR
關於熒光定量PCR基本概念（基線、熒光閾值、CT值、擴增曲線、熔解曲線），如果不瞭解的話可以參考這份鏈接：https://wenku.baidu.com/view/668d2e0b79563c1ec5da713d.html
1.1 熒光定量PCR與常規PCR
qPCR(quantitative PCR)：利用熒光信號的變化實時監測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，並進行定量分析。
常規PCR：對PCR擴增的終產物進行定量和定性的分析，無法對擴增反應實時監測。
1.2 熒光定量PCR如何監測產物量變化
如何實現監控信號：
在PCR體系中添加某種可發光物質，使用信號檢測器檢測
1） DNA嵌合型分子
sybr green：非特異性結合到DNA雙鏈，產生熒光信號--反應體系內雙鏈DNA濃度越高，熒光信號越強
2） 熒光標記的寡核酸序列
TaqMan 探針：探針5'端存在熒光基團，3'端存在猝滅基團，探針完整存在時不會發出熒光。當PCR反應體系中，探針特異性結合到DNA模版鏈，在DNA複製過程中，由於DNA聚合酶具有核酸外切酶活性，可以將探針從模版上切割下來，使熒光基團與猝滅基團分離，從而產生熒光。反應體系內，TaqMan探針結合的目標序列越多，熒光信號越強。
| SYBR Green染料法 | Taqman 探針法 | |
|---|---|---|
| 結構 | 嵌合型核酸染料 | 5' R --- Q3' |
| 優勢 | 成本低；有熔解曲線生成 | 特異性高；低丰度基因定量可信度高 |
| 劣勢 | 特異性較 Taqman 低 | 成本高；引物二聚體的形成，無法直觀判定 |
| 應用 | SNP分型、表達定量分析、基因突變檢測、病原菌檢測 | 病毒檢測、病毒載量檢測、基因分型、基因突變檢測、SNP分型、表達量分析等 |
1.3 qPCR的擴增曲線
從“qPCR的擴增曲線”這張圖就可以看到，隨着循環數的增加，熒光信號強度逐漸增加
- 基線期：沒有明顯的熒光信號
- 指數擴增期
- 線性擴增期
- 平臺期（酶活性降低，dNTP被消耗盡）
2. 新冠病毒檢測（RT-PCR）
我的文字會很囉嗦，不如視頻看着舒服，如果視頻不理解可疑參考文字指引
https://www.bilibili.com/video/BV1454y1Q7U2/?spm_id_from=333.788.videocard.0
RT-PCR（reverse transcription polymerase chain reaction）逆轉錄-聚合酶鏈式反應
包括以下幾個步驟：
採集樣本 --> 提取RNA--> RT成cDNA --> PCR擴增 --> 結果分析
2.1 採集樣本
上呼吸道：咽拭子、鼻拭子
下呼吸道：痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液
採集後低溫封存，儘快檢測
2.2 提取RNA
常用方法：Trizol法、離心柱法、磁珠法
這裏只記錄Trizol法
1）Trizol 裂解
病毒的遺傳物質爲RNA，常常和蛋白質包裹在一起形成擬核。
Trizol的主要成分是苯酚，加入苯酚能夠裂解病毒的蛋白質成分，將RNA從病毒中游離出來。
2）氯仿抽提
氯仿使蛋白質變性沉澱，同時氯仿是有機溶劑，苯酚易溶於氯仿中，而RNA易溶於水卻不溶於有機溶劑。
經過離心，RNA存在於上層水相中，從而將RNA與蛋白質分離並抽提到水相。移液管將上層水相吸取到另一個乾淨的離心管中。
3）異丙醇沉澱
異丙醇能夠奪取RNA周圍的水分，使RNA聚集而發生沉澱，因此，在離心管中加入異丙醇並離心，獲得RNA沉澱。
4）乙醇洗滌
RNA不溶於乙醇，而殘留的異丙醇和雜質可以溶於乙醇。因此乙醇洗滌後離心並棄去清夜，達到提純RNA的目的。
5）晾乾
6）DEPC水溶解
DEPC爲焦碳酸二乙酯，能夠破壞RNase的活性（RNA容易降解，因爲降解RNA的酶RNase無處不在）
使用DEPC水溶解RNA，能夠保持RNA的完整性
2.3 逆轉錄獲得cDNA
反應體系需要加入 oligo(dT)作爲逆轉錄引物（因爲病毒RNA3'端存在polyA尾巴）、逆轉錄酶、dNTP
根據鹼基互補配對原則，逆轉錄酶以RNA爲模版沿着5'到3'端合成鹼基互補的DNA鏈（即cDNA）
2.4 qPCR擴增
這裏採用的是探針法qPCR（👆上面1.2中提到的方法），即以cDNA某一高度保守基因序列區爲檢測靶標，通過PCR擴增，使這段靶標數量呈指數級增加。擴增的同時，產生強度與靶標數量對應的熒光信號，通過檢測熒光信號來確定樣本中是否含有病毒核酸。
2.5 結果分析
設定熒光閾值：以第3到第15個循環的熒光信號強度的標準偏差的十倍設定爲熒光信號的閾值
獲得Ct值：熒光閾值線與擴增曲線產生交點，交點對應的橫座標爲Ct值（Ct值的含義代表熒光信號強度達到閾值時所經歷的PCR循環數）
陰性情況：
不存在Ct值：
Ct值>40
陽性情況：
Ct值<37
可疑情況：
37<Ct值<40（建議重複實驗）
