這篇筆記是記錄CUT&RUN實驗的具體步驟。因爲下週就要做CUT&RUN了，首先就要先熟悉一下實驗步驟。雖然有紙質版的protocol，但是老闆推薦我去試劑盒官網看一下視頻，可以更清晰的瞭解一下原理和步驟，以及注意事項。官網視頻：https://www.epicypher.com/resources/protocols/cutana-cut-and-run-protocol/
（一）概述與實驗設計
Concanavalin A或者說是ConA beads被lectin（凝集素）包裹，這個beads可以結合細胞膜/細胞核上的glycoconjugates（糖複合物）。膜是通透的，染色質可以被特異的抗體結合，在我們的這個例子裏，選擇的是PTMs。下一步，加入AG蛋白-micrococcal核酸酶（也叫做pAG-MNase），這個pAG-MNase結合到抗體連接的染色質上，然後通過適量濃度的Ca2+來激活pAG-MNase，從而切割DNA。被切下來的DNA遊離到上清裏，通過離心我們可以把這些抗體結合的DNA分離出來。
之後提取DNA，製備文庫，然後進行測序。
最後就可以進行數據分析了。
（二）注意事項
CUT&RUN實驗可以用來分析多種蛋白的染色質圖譜，包括PTMs，轉錄因子，染色質remodelers和染色質writers/readers。
如果你是第一次使用這個技術，請全面考慮你的細胞類型、實驗條件、對照、抗體，從而解決你的生物學問題。這個試劑盒可以兼顧多種細胞類型（我現在的實驗室裏用的就是這個試劑盒）。
對於未固定的細胞，是研究組蛋白PTMs和轉錄因子理想的實驗材料。這種細胞可以有多種來源，包括貼壁、懸浮細胞，組織樣品。
CUT&RUN也可以用lightly-crosslinked細胞（翻譯成輕微固定的細胞？），樣品固定一般用於研究一些染色質瞬時作用因子和某些PTMs。
當然你也可以提取nuclei，這種方法用於研究那些量很少的PTMs和蛋白。另外，當你的實驗材料是免疫細胞時，也推薦提取nuclei，因爲ConA beads可以激活某些免疫細胞。還有要提一下的是所有的材料都可以低溫儲存。
細胞數量上，推薦每個樣品50萬細胞。當然你需要嘗試不同的細胞數量來優化你的實驗。對於這個試劑盒來說，最少你可以用5000個細胞來進行實驗。
對照和標準化是整個實驗的關鍵步驟。陽性對照推薦使用H3K4me3或者H3K27me3,；陰性對照推薦使用Rabbit IgG。你還可以使用spike-in來進行標準化。
CUT&RUN有6種主要試劑。這裏需要注意的是，根據你的實驗材料是細胞、nuclei、或者固定的細胞，所使用的試劑是不一樣的（這裏試劑列表就不貼了，有需要的同學可以去試劑盒官網看具體細節）。另外，有些試劑是需要現用現配的，官網說明書裏寫的很詳細。
（三）實驗步驟
（1）第一部分：beads活化
beads的活化在1.5ml tube裏進行，你還需要與之匹配的magnetic rack。儘量不要用8連管，那樣會損失很多。活化buffer要放置在冰上。
首先震盪beads（設置6檔或7檔），然後快速離心一下。然後把beads放在magnetic上，待溶液澄清了，吸走上清。然後用活化buffer清洗beads 30秒（清洗兩次）。最後清洗完，還是用活化buffer重懸beads。這裏要注意，beads要放置在冰上。下面是第一部分的總結圖：
（2）第二部分：將beads結合到細胞上
這一部分用的wash buffer請放置室溫，防止刺激到你的細胞。這一步如果用8連管，每一管的細胞應在4.4milion。你可以首先收集你的細胞，同樣是用wash buffer清洗細胞兩次，最後用wash buffer重懸你的細胞。之後把beads加入到細胞懸液裏。輕微震盪或用移液槍吹打。室溫靜置10分鐘。
下面是第二部分的總結：
（3）第三部分：抗體結合
上一步靜置後，把beads放在magnetic上，移除上清。加入冷的抗體buffer，這一步要快，防止beads乾燥，但是不要太劇烈，防止細胞裂解。然後加抗體，陰性對照抗體1:10添加，陽性對照抗體1:100添加。輕微震盪，放在搖牀上孵育過夜（4度，16小時）。下面是第三部分的總結：
首先快速離心8連管，把管放在magnetic上。待溶液澄清，移除上清。加入冷的dinitonin buffer。清洗2遍。清洗後用dinitonin buffer重懸beads。
（4）第四部分：結合pAG-MNase
pAG-MNase和digitonin buffer應放置在冰上。在樣品里加入pAG-Mnase，室溫孵育10分鐘，快速離心，放置magnetic上，移除上清。使用digitonin buffer清洗beads兩遍。然後用digitonin buffer重懸beads。
（5）第五部分：切割DNA
把樣品放在冰上，加入CaCl2，這一步很關鍵，因爲Ca會活化pAG-MNase，輕微震盪後，搖牀上4度孵育2小時。之後加入stop buffer。如果你想加入spike-in，那麼加完stop buffer後可以加入spike-in DNA。
37度10分鐘。之後把tube放在magnetic上，把上清液移到新的管裏。之後使用DNA purification kit。
（6）第六部分：DNA洗脫到測序
上一步純化DNA後，推薦10ul體積洗脫。使用1ul進行Qubit檢測濃度。一般來說，如果每個樣品的細胞數約0.5個million的話，下面有一些濃度參考：
下面就是製備文庫了。就是跑PCR。這裏要注意的是，如果你要研究的是轉錄因子，那麼你要優化你的PCR條件，因爲轉錄因子的文庫片段小於120bp。然後使用bioanalyzer來檢測片段富集：
最後就是測序了。一般每個樣品3-5個million就可以了。
（四）實驗可選步驟
（1）nuclei提取
上面已經提到了，如果你的細胞是免疫細胞，要提前提取nuclei，因爲ConA beads上的lectin在結合細胞的時候，會對免疫細胞有影響。pAG-MNase會通過核孔進入到核中。需要注意的是，digitonin buffer濃度要保持0.01%，防止beads粘附到tube上。
（2）交聯細胞或nuclei
需要注意的是，我們平時做ChIP-seq的交聯方法是不適用於CUT&RUN的。這裏使用的是lightly crosslinking。
（3）凍存和貼壁細胞的處理
這裏要注意的是，凍存細胞是90%培養基+10%DMSO中放置在-80度裏保存的。不要用液氮快速冷凍你的樣品，因爲會使你的細胞裂解、染色質外漏，會導致你的背景信號非常高。在進行CUT&RUN步驟之前，37度快速解凍細胞。
對於貼壁細胞，不要用胰酶消化細胞！！！因爲細胞表面的glycoprotein要結合beads。所以貼壁細胞只能用“刮”的。