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● 前言
2020年8月，香港浸會大學化學系環境與生物分析國家重點實驗室在Science Bulletin期刊發表了題爲“Airborne fine particulate matter induces cognitive and emotional disorders in offspring mice exposed during pregnancy”的研究成果，該研究以C57BL/6受孕小鼠爲研究對象，結合形態學、脂質組學和三維(3D)-MALDI-MSI（空間脂質組學）的分析方法被用於研究胎兒、後代和胎盤中的PM 2.5毒性，並用於識別與認知和情緒障礙相關的特定結構中的脂質標記物。
中文標題：懷孕期間暴露於空氣中細顆粒物會導致子代小鼠出現認知和情緒障礙
研究對象：小鼠、小鼠胎盤、海馬組織
發表期刊：Science Bulletin
影響因子：9.511
發表時間：2020.8.28
發表單位：香港浸會大學化學系環境與生物分析國家重點實驗室
運用生物技術：LC-MS/MS脂質組學+MALDI-MSI空間脂質組
● 研究背景
PM2.5暴露被發現穿透中樞神經系統，並通過產生氧化應激和炎症反應誘導異常行爲。暴露於PM2.5可能會產生神經炎症和多巴胺神經毒性，並誘發中樞神經系統疾病。此外，懷孕期間的空氣污染、營養和吸菸，會通過胎盤調節對胎兒和後代的發育產生負面影響。胎盤的主要功能是胎兒和母親之間廢物和營養的轉移，其在調節胎兒-母體免疫系統和調節母體血液中的外源化合物方面起着重要作用。它還分泌激素和一些重要分子來影響胎兒的發育和生長。潛在靶器官的精確定位對於準確評估妊娠PM2.5毒性和母體PM2.5暴露誘導的子代毒性至關重要。基質輔助激光解吸/電離質譜成像(MALDI-MSI)已被用作在綜合組織分析中識別各種分子以揭示空間分佈和形態特徵的強大工具。
● 研究思路
● 研究方法
1.研究材料
實驗對象爲小鼠，設計了組0(n=8；包括對照和PM2.5暴露)，用於在E14收集胎兒性腺(卵巢和睾丸)。組1(n=26；包括對照和PM2.5暴露)，用於收集胎盤和胎兒樣本。在E18，處死懷孕小鼠，收集第1組的胎盤和胎兒。2組(n=26包括對照和PM2.5暴露)用於收集後代海馬體。在出生後d49 (PND 49)，在第2組中對子代小鼠(每組26只)進行1周馴化後的行爲測試。行爲測試後，收集組織(每組8個)進行形態學、脂質組學和MALDI-MSI分析。
2.組學分析
LC-MS/MS脂質組+MALDI-MSI空間脂質組
3.檢測方法
（1）形態學觀察和行爲測試；
（2）LC-MS/MS脂質組檢測；
（3）MALDI-MSI空間脂質組檢測；
● 研究結果
1.PM2.5誘導後代認知和情緒障礙
本次研究，在18天的妊娠中，從E0到E18，每2天用PM2.5（實驗組）或生理鹽水(對照組)處理懷孕小鼠，使用PND49子代小鼠進行行爲評估，包括步降試驗、高架十字迷宮試驗和強迫游泳試驗（圖1a）。如圖1b所示，在d1(記憶獲得期)期間，PM2.5處理組與對照組相比，雌性後代潛伏期存在顯著差異(P < 0.01)，雌性後代的錯誤數量顯著增加(P < 0.01，圖1c)。在d2期，雌性子代潛伏期顯著縮短(P < 0.001，圖1d)，並且在雌性後代中觀察到錯誤的數量顯著增加(P < 0.001，圖1e)。上述結果表明，妊娠期PM2.5暴露顯著損害了雌性後代記憶的獲得和鞏固。焦慮樣反應通過高架十字迷宮試驗進行評估，顯示PM2.5處理組的雌性後代的行爲焦慮增加，雄性組焦慮樣反應無顯著性差異(P > 0.05，圖1f)，表明經PM2.5處理的雄性組沒有焦慮趨勢。暴露於PM2.5的雄性和雌性在強迫游泳試驗中保持不動的時間沒有任何顯著差異(圖1g)。
圖1 | PM 2.5暴露後對子代認知和情緒障礙的影響
2.PM2.5暴露誘導海馬損傷
選擇形態學變異作爲分子損傷的指標，以評估PM2.5誘導的子代大腦海馬損傷(圖2)。採用尼氏染色法觀察妊娠期PM2.5暴露對子鼠海馬細胞結構的影響。與相應的對照組(圖2a)相比，用PM2.5處理顯著減少了PND49上雌性後代的海馬角菊石1 (CA1)、CA3和齒狀回(DG)區域中的神經元細胞的數量(圖2b)。形態學結果還顯示，除CA1區外，雄性後代海馬CA3區和DG區的神經變性增加(圖2c和d)。與對照組相比，PM2.5暴露導致尼氏體損傷，包括排列紊亂和細胞質減少。此外，在PM2.5處理組中檢測到海馬CA3和DG區域的鬆散連接和結構萎縮(圖2b和d)。
圖2 | PM2.5誘導組織損傷的形態學分析
3.子代海馬和胎兒腦脂質代謝紊亂
除了形態學上的顯著變化，作者還對與PM2.5毒性相關的脂質代謝機制進行了進一步的探索。爲了研究脂質代謝在PM2.5損傷中的作用，採用基於LC-MS/MS質譜的脂質組學對暴露於PM2.5的組織進行分析。通過偏最小二乘判別分析(PLS-DA)，在PM2.5處理組和對照組的後代海馬和胎兒腦中發現顯著不同的脂質。暴露於PM2.5後，觀察到不同性別的子代和胎兒中脂質標記物的顯著變化。中性鞘糖脂[CeG1]，神經酰胺[Cer]，鞘磷脂[SM]，磷脂酰肌醇[PI]，磷脂酸[PA]和磷脂酰甘油[PG]顯著上調，與雄性組相比，來自PM2.5處理組的雌性子代海馬中的脂質標記物增加了3.0至6.4倍。結果表明，暴露於PM2.5後不同性別的脂代謝變化可能與雄性海馬調控相關的行爲改變更相關。
4.子代海馬的空間脂質組分佈
脂質組的結果表明，PM2.5處理在小鼠海馬毒性中起着關鍵作用。然而，尚不清楚脂質標記物的空間分佈是否被重新編程，以及海馬和胎兒中的異質性相關的結構是否與後代中認知和情緒障礙的產生相關。MALDI-MSI提供了一種在空間分佈和豐度變化中可視化目標分子的原位方法。
通過觀察子代海馬形態和脂質代謝的顯著變化，進一步研究了脂質的空間分佈是否也發生了變化。以N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽(NEDC)爲基質的MALDI-MSI和多元統計分析的結果如圖3所示。PM2.5處理和對照小鼠的分割和概率潛在語義分析(pLSA)顯示出明顯的差異(圖3a-e)。
圖3 | MALDI-MSI分析後代腦中脂質標記物的丰度變化和空間分佈
5.胎兒腦中脂質的空間分佈
考慮到後代海馬對PM2.5的暴露很敏感，作者想知道胎兒大腦是否也可能在PM2.5引起的認知和情緒障礙中發揮作用。空間分割顯示胎兒大腦與胎兒其他部分明顯分離(圖4a-d)。
圖4 | MALDI-MSI分析胎兒全身脂質標誌物的丰度變化和空間分佈
爲了評估PM2.5暴露是否導致胎兒腦中脂質代謝物空間分佈的改變，通過3D重建和多元統計方法(圖5)在不同深度對照組和PM2.5處理的雌性和雄性小鼠的40-51個全身胎兒的連續切片進行組裝。胎兒的連續切片結果顯示，從大腦到腳(水平)，從左到右(垂直)，暴露於PM2.5後，胎兒大腦中的九種脂質標記物顯示出特定的空間分佈差異。令人驚訝的是，Cer (d36:2)、CerG1 (d40:1)、DAG (38:6)、LPC (18:1)、PA (36:4)、PG (42:10)、PI (38:5)和SM (d44:1)顯示出清晰的分佈。
圖5 | 3D展示胎兒中脂質的空間分佈
此外，通過在胎兒腦中使用常規的2D MALDI-MSI分析，識別出具有顯著差異的脂質標記物，並將其與胎兒腦的結構定位在一起(圖6)。與雄性組相比，上調的PG (42:10)、Cer (d36:2)和CerG1 (d40:1)被鑑定並共同位於背側大腦皮層(等角皮質)和海馬結構(Hpf)區域，上調的PA (36:4)和SM (d44:1)被鑑定並共同位於雌性胎兒大腦的中腦和髓質(圖6)。
圖6 | 雌性和雄性胎兒脂質標記物的代表性MALDI-MSI圖像
6.PM2.5誘導的胎盤損害和脂質變異
鑑於後代海馬體和胎兒大腦是對PM2.5誘導的行爲障礙做出反應的目標器官，作者想知道胎盤功能障礙是否是由妊娠暴露於PM2.5引起的。經PM2.5處理組的形態學分析顯示，與對照組小鼠相比，在雌性胎盤交界區(JZ)出現了嚴重的細胞損傷。妊娠期暴露於PM2.5會損害胎盤細胞結構，這可能隨後破壞胎盤器官發生，誘導胎盤功能障礙並導致胚胎髮育異常。在經PM2.5處理的組中，在具有95%置信區間的五個成分的pLSA圖上發現具有顯著差異的脂質標記物，其在包括LZ、JZ和MD的整個小鼠胎盤中不同地分佈(圖7a)。在PM2.5處理組中，7種脂質分佈於整個胎盤並顯著上調，包括SM (d34:1)、Cer (d42:1)、PE (38:4)、PE (40:6)、PS (40:6)、DAG (36:4)和三酰甘油[TAG] (54:2)。小鼠胎盤LZ中CerG1 (d34:0 + pO)的丰度增加(圖7c)。
圖7 | MALDI-MSI分析胎盤脂質標誌物的丰度變化和空間分佈
● 相關討論
胎盤代謝途徑調節胎兒大腦發育，研究結果表明，PM2.5通過胎盤功能障礙誘導了子代海馬體的變異以及認知和情緒障礙。脂類在胎盤發育和形態變異中也起着關鍵作用，與健康胎盤相比，患者胎盤中的脂質丰度顯示出不同的表達。胎盤，聯繫懷孕期間的母體炎症和新生兒，被認爲是後代大腦發育的一個重要因素。
PM2.5通過生物分子在母體-胎盤-胎兒相互作用中的綜合作用，以性別特異性差異的方式誘導認知和情緒障礙，包括上調的促炎作用、5-羥色胺合成的減少以及對GPs和SPs生物合成和降解的干擾。脂質代謝結果表明，在整個女性母體-胎盤-胎兒相互作用中，GPs(上調的PA、DAG、PG和PI，以及下調的PE)和SPs(上調的Cer和SM)的生物合成和降解受到干擾。
作者還發現，與無帕金森病的組相比，帕金森病患者的人腦脊液中9種脂質標記物的變化相同，但腦積水和腦動脈血栓形成除外。總之，從脂質標記物的變化來看，AD小鼠和人類腦脊液樣品的結果與PM2.5暴露小鼠模型顯示出良好的一致性。表明脂質代謝紊亂與神經退行性疾病的進展密切相關。
● 研究結論
本文研究發現，PM2.5通過生物分子在母體-胎盤-胎兒相互作用中的綜合作用，以性別特異性差異的方式誘導認知和情緒障礙，包括5-羥色胺合成減少和胚胎髮育障礙，作者通過使用2D和3D MALDI-MSI突出了胎盤、胎兒腦和後代腦中潛在靶器官的精確定位。通過對懷孕小鼠模型的研究，闡明瞭妊娠期暴露於PM2.5會導致形態學損傷，以及胎盤、胎兒和後代海馬體特定區域脂質譜的改變，這可能在雌性後代的認知和情緒障礙中起作用。作者還驗證了阿爾茨海默病小鼠海馬和人腦脊液樣本中脂質標記物的變化。這項研究是第一份關於通過擾亂形態學驅動的脂質代謝而導致PM2.5誘導的行爲障礙的報告。該研究提供了PM2.5毒性的有價值的信息和對分子機制的理解。
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本研究通過LC-MS/MS脂質組學和MALDI-MSI空間脂質組的研究，闡明瞭妊娠期暴露於PM2.5會導致形態學損傷，以及胎盤、胎兒和後代海馬體特定區域脂質譜的改變，這可能在雌性後代的認知和情緒障礙中起作用。
文末看點
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文章來源於鹿明生物