摘要:類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderia pseudomallei)是引起主要發生在東南亞和澳大利亞北部的一種人獸共患病類鼻疽的潛在病原。明確該疾病致病機理及其宿主與病原的互作將加強對該條件致病菌的發病機制的理解。本研究從影響細菌致病性的毒力因子和病原與宿主互作兩個方面闡述類鼻疽伯克霍德爾菌的致病機理，爲該菌的有效控制提供可能的機制。
關鍵詞:類鼻疽伯克霍爾德菌;毒力因子;宿主病原互作;致病機理
類鼻疽是類鼻疽伯克霍爾德菌，是廣泛分佈於熱帶和亞熱帶泥土中的腐生菌，農民在田間勞作的過程中通過皮膚粘膜感染引起類鼻疽病(Melioidosis)。類鼻疽伯克霍爾德菌爲革蘭陰性、有運動性的短桿菌。1911年，Whitmore從仰光38例類似鼻疽的病人中分離獲得，命名爲類鼻疽桿菌(文章分別發表在1912和1913年)，以後將其歸入假單胞菌屬(Pseudomonas)。20世紀90年代初日本學者將該菌重新分類，將原假單胞菌屬中的DNA羣Ⅱ中的幾個種列入1個新屬伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)［1，2］。
類鼻疽伯克霍爾德菌致病範圍廣，人和動物可以通過接觸環境中的病原菌，經由攝取、或吸入、或開放的傷口、或皮膚擦傷而感染。能感染的動物包括海洋動物在內的哺乳動物以及某些鳥類，與人類有密切關係的動物如馬、牛、羊、豬、犬和貓均有感染報道。本病潛伏期一般爲3～5 d，但也有感染後數月、數年，甚至有長達62年後發病，即所謂“潛伏型類鼻疽”，此類病例常因外傷或其他疾病而誘發。臨牀表現複雜，有急性敗血症者常伴多處化膿性損害，慢性者類似空洞型肺結核表現。感染後病變是肺出血、肝脾腫大，有乾酪樣壞死病竈，雄性動物睾丸腫脹。病情一般較爲嚴重，如不及時治療，病死率甚高。
類鼻疽伯克霍爾德菌和所有土壤桿菌一樣，很難殺死，能在三蒸水中存活數年。該菌能夠抑制補體、溶酶體保護機制、陽離子肽，它還能產生蛋白酶、脂酶、卵磷脂酵素、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、溶血素、細胞毒素胞外脂類和至少一種含鐵細胞。類鼻疽的死亡率高達39．5%，不治療的敗血症死亡率達80%以上。
本研究從影響細菌致病性的毒力因子和細菌與宿主之間的互作兩個方面綜述類鼻疽伯克霍爾德菌的致病機理，爲該菌的有效控制提供可能的機制。
1 細菌的毒力因子
類鼻疽伯克霍爾德菌的毒力由細胞結合性和分泌性兩大類物質因素構成。一般而言，細胞結合性物質是防禦性物質，使得細菌本身免受特異性和非特異性免疫因子的殺滅，而分泌性物質直接引起組織器官的病理變化。類鼻疽伯克霍爾德菌能夠產生許多與毒力相關的分泌性物質，如蛋白酶、脂酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和溶血素等，其中一些毒力因子也與免疫逃避機制有關。與其他革蘭陰性菌相比，對該菌的毒力因子作用機制缺乏深入地研究。有研究發現，Ⅲ型分泌系統和羣感知系統與該病原菌的毒力密切相關。由於基因的水平轉移或缺失，不同地區的分離株在基因組、轉錄水平和蛋白質組均有很大差異，表現出了遺傳學上的多樣性。
1．1 Ⅲ型分泌系統
新近的研究表明，Ⅲ型分泌系統(T3SS)是引起革蘭陰性菌致病性的重要毒力因子［3～6］。研究發現，類鼻疽伯克霍爾德菌存在3個Ⅲ型分泌系統，其中T3SS1(BPSS1390-1408)僅在類鼻疽伯克霍爾德菌發現，鼻疽伯克霍爾德菌和泰國伯克霍爾德菌沒有;而T3SS2(BPSS1613-1629)和T3SS3(BPSS1520-1554)在這3個種屬的伯克霍爾德菌均存在［4］。T3SS1和T3SS2與植物致病性相關，是西紅柿感染伯克霍爾德菌必需的毒力因子，而非倉鼠感染所必需。而T3SS3與沙門氏菌和志賀氏菌的Inv/Mxi-Spa系統存在同源性，在鼻疽伯克霍爾德菌和類鼻疽伯克霍爾德菌感染過程中有重要作用。該基因簇編碼的分泌體，功能類似於分子注射器，該系統的亞單位與真核細胞的細胞膜互作，把三型分泌系統的效應分子轉移至靶細胞的胞質，然後破壞宿主細胞的細胞週期。體外研究表明，T3SS3能夠促進病原菌對健康細胞的入侵、從內涵體的逃脫、在細胞內的存活和繁殖，並且是誘導細菌細胞凋亡所必需的因素。研究發現，傷寒沙門菌的T3SS突變體抑制了細胞的入侵和腸病發生。T3SS3突變的病原菌仍能夠從內涵體逃脫，但與野生型相比，在時間上延遲。細菌內化後，從內吞體逃脫進入細胞漿感染細胞。在一極誘導肌動蛋白聚合形成膜突出從而發生細胞間的傳播。缺乏Bsa分泌和轉移系統的類鼻疽伯克霍爾德菌突變體，降低在鼠類巨噬細胞的複製，不能從內吞體逃脫、形成膜突出和肌動蛋白聚合;BopE是與沙門菌SopE/SopE2同源的蛋白，該蛋白是鳥嘌呤核苷酸交換因子，失活該蛋白，可以減弱細菌進入Hela細胞的能力，說明BopE促進細菌入侵。此外，類鼻疽伯克霍爾德菌bsa位點編碼的沙門菌sip轉移子同源蛋白(BipB，BipC，BipD)，這些蛋白是沙門菌效應蛋白注入和細菌入侵上皮細胞所必需的［5］。突變類鼻疽伯克霍爾德菌的bipD基因，該菌入侵上皮細胞的能力削弱。缺失轉移系統的BipD突變體，病原菌腹腔內或鼻內感染BALB/c小鼠的能力減弱，在肝臟和脾臟的繁殖能力降低［6］。有研究表明［7］，BipB介導了多核大細胞的形成，細菌的細胞間傳播，以及被感染的宿主細胞的凋亡。BipB突變體病原菌削弱了BALB/c小鼠的鼻內感染。
最新的研究表明，Ⅵ型分泌系統(Type VI Secretion System，T6ss)也是伯克霍德爾菌的毒力基因決定簇，T6ss基因簇編碼15～20個蛋白參與分泌系統的組裝、結構和功能［8］。在類鼻疽伯克霍爾德菌的T6SS命名爲tss-5，能夠誘導病原菌在巨噬細胞的生活週期;突變或缺失該基因，能夠減少細菌在上皮細胞的噬斑和細胞間的傳播。因此認爲tss-5是類鼻疽伯克霍爾德菌的重要毒力決定簇，但關於這個分泌系統的效應分子目前還不清楚。
1．2 羣感知系統
大多革蘭陰性菌通過產生N-乙酰同型絲氨酸(N-acyl-homoserine lactone，AHL)信號分子來監控其自身在羣感知系統中的羣體密度。通常，高羣體密度引起一系列後果，如致病需要的毒力因子功能的表達，這種基因調控的形式確保細菌保留在宿主的免疫系統中。直到他們足夠高的密度以壓倒宿主，並建立感染。
在B菌種存在這些信號分子的證據源自交叉培養試驗，結果發現，AHL包含的營養耗竭的培養基能夠刺激含鐵細胞、蛋白酶和脂酶的產生［9］。B菌第1個QS基因發現於轉座子突變的掃描中。BK56-2菌的QS系統由AHL合成酶CepI和轉錄調控子CepR組成，前者酶指導合成N-庚酰同型絲氨酸(C8-HSL)，檢測N-己酰同型絲氨酸(C6-HSL)的產生。在低種羣密度時，細胞通過激活CepI合成酶產生基礎水平的AHLs，隨着細菌密度增加，AHL信號分子在生長介質中積累，當達到一個界限濃度，AHL結合到同源LuxR型受體蛋白CepR，從而誘導或抑制靶基因。CepR緊密控制cepI的表達，主要通過結合到lux盒子類似序列，該序列與cepI啓動子的-35區部分重疊。這種正反饋調節保證一旦該系統啓動，靶基因表達快速增加［10］。
研究B菌的羣感知系統揭示，CepI/CepR系統正調節細胞外蛋白酶、殼多糖酶、多聚半乳糖醛酸酶的表達，菌羣的運動，菌膜的形成，抑制鐵細胞分泌蛋白的合成。B．H111羣感知系統缺陷的突變體僅形成平的未分化的生物膜。進一步定量分析生物膜結構表明［11］，CepI/CepR系統不參與細胞在非生命體表面的吸附，但控制生物膜的成熟。CepI/CepR系統影響B菌在不同宿主的毒力。
細胞密度依賴的羣感知系統使用N-酰基同型絲氨酸內酯(AHLs)調節基因表達，LuxI負責AHL的生物合成，LuxR是轉錄調節因子，還有一些同源的AHLs。這些蛋白因子參與基因表達或抑制基因表達。據報道，類鼻疽伯克霍爾德菌基因組包含3個LuxI和5個LuxR羣感知系統同族體。質譜分析類鼻疽伯克霍爾德菌培養物的上清液表明，該上清液存在許多信號分子，包括N-癸酰同型絲氨酸內酯和N(3辛-癸酰)-L-同型絲氨酸內酯。破壞羣感知系統的這8個同源基因導致腹腔內接種的敘利亞大鼠的半數致死量明顯增加，延長了BALB/c小鼠從接種到死亡的時間，減少了病原菌對器官的侵襲。命名爲PmlI-PmlR的LuxI-LuxR同源體，指導N-癸酰同型絲氨酸內酯的合成，參與調解金屬蛋白酶合成，是該菌實驗動物感染模型的毒力所必需，最佳毒力發揮和外源毒素分泌也需要同源物BpsI-BpsR的參與［12］。有些羣感知系統控制潛在毒力因子和致病過程，如含鐵蛋白、磷酸酯酶C和菌膜的形成等都可能依賴於BpeAB-OprB，類鼻疽伯克霍爾德菌中衆所周知的一種多藥外排泵系統，與該菌的抗生素耐藥性如氨基糖苷和大環內酯物的抗性有關。由於N-癸酰同型絲氨酸內酯和N-辛酰同型絲氨酸內酯能夠誘導BpeAB-OprB的表達，羣感知系統調節BpeAB-OprB操縱子。BpeAB突變體弱化了該菌的細胞入侵和人類肺上皮細胞(A549)和人巨噬細胞(THP-1)的細胞毒性［13］。
1．3 莢膜多糖
類鼻疽伯克霍爾德菌的莢膜在普通光學顯微鏡下很難發現，在電子顯微鏡下可見到細菌外部附有一層絲狀物——莢膜多糖，由1，3鍵相連的多聚2-O-己酰基-6-脫氧-β-D-甘露糖-庚吡喃糖殘基構成，先前認爲是I型O抗原多糖，現在基於高分子羣體和遺傳相似性研究更傾向於是莢膜多糖。莢膜多糖是類鼻疽伯克霍爾德菌實驗動物感染模型毒力所必需的。與野生型相比，在血清存在時誘導莢膜表達或在血清殺菌檢測中加入莢膜，能夠使類鼻疽伯克霍爾德菌SLR5(一種血清敏感菌株)的存活增加1 000倍。有莢膜的菌株和沒有莢膜的變異株在吞噬細胞吞入率尚沒有明顯差異，其莢膜的抗吞噬作用主要表現在抗溶菌酶體功能上，這一現象是類鼻疽潛伏期可長達數10年之久的原因之一。有學者以同源重組的原理構建了莢膜基因缺失突變株，試驗證明莢膜的缺失導致補體C3b在菌體表面的沉積增多［14］。另外，莢膜還與該菌對環境的抵抗力和抗生素抗性有關。
1．4 脂多糖
脂多糖是先前命名的Ⅱ型O抗原多糖，類鼻疽伯克霍爾德菌的脂多糖似乎與其他革蘭陰性菌不同。與其他腸桿菌的脂多糖相比，該菌的脂多糖在齧齒類動物的產熱活性減弱，但增強了鼠類動物脾細胞的促有絲分裂活性。與埃希大腸桿菌的脂多糖相比，該菌的脂多糖體外介導肥大細胞活化能力減慢［15］。
類鼻疽伯克霍爾德菌的O抗原分爲I型和Ⅱ型。I型O抗原由1，3鍵相連的多聚2-O-己酰基-6-脫氧-β-D-甘露糖-庚糖殘基構成。Ⅱ型 O 抗原由多聚(-3)-β-D-葡萄糖-(1，3)-脫氧-α-L-太羅糖構成［16］。Ⅱ型O抗原基因缺失突變株對糖尿病模型動物的LD50比野生型大140倍，所以Ⅱ型O抗原可能是該菌毒力的影響因子［17］。雖然人和動物的補體能夠在菌體表面形成膜攻擊複合物，並且完成外膜打孔，但整體而言該菌有着很強的抗補體殺滅機制。近期的研究表明，Ⅱ型O抗原是抗補體殺滅作用的分子基礎。
1．5 Ⅳ型菌毛
Ⅳ型菌毛是許多革蘭陰性菌的重要毒力因子，與細菌的黏附有關。類鼻疽伯克霍爾德菌K9624基因組包含多個Ⅳ型菌毛相關位點，其中包括1個公認的菌毛結構蛋白PliA。體外研究表明，類鼻疽伯克霍爾德菌可以附着於人類肺泡、支氣管、喉部、口腔、結膜和子宮組織的上皮細胞系，而且30℃時接種細菌對這些上皮細胞的黏附能力比37℃更強。與其他伯克霍爾德菌相比，該菌對呼吸道上皮細胞的入侵、黏附和細胞損傷更有效。缺失PliA蛋白，減少了細菌對人上皮細胞的黏附性、線蟲毒力模型的毒力以及鼠類類鼻疽發病，這些結果說明Ⅳ型菌毛在類鼻疽伯克霍爾德菌的毒力中起一定作用［18］。
1．6 鞭毛
類鼻疽伯克霍爾德菌鞭毛的氨基酸序列已經清楚，碳端和氮端的氨基酸較爲保守，中間部分的氨基酸序列具有一定的可變性，因而編碼這一段氨基酸序列的基因引起研究者的關注。有體外研究表明，野生型和鞭毛突變體病原菌在人肺細胞的入侵和複製沒有不同;而其他研究者的活體研究得出不同的結果，以轉座子誘變技術構建了類鼻疽伯克霍爾德菌鞭毛基因(filC)缺失突變菌株，試驗結果表明該菌株喪失了運動性，與原始菌株相比，失去對BALB/c小鼠的致病性，無論是通過鼻腔接種還是腹膜內接種均不能引起發病;而另外的研究得出，野生型和鞭毛基因突變體在糖尿病小鼠和敘利亞大鼠的感染模型沒有差異［19］。
2 宿主的免疫機制
類鼻疽伯克霍爾德菌感染後機體能夠產生針對莢膜多糖、O-PS多糖和鞭毛蛋白等抗原成分的特異性抗體，抗體種類以IgG爲主。這些抗體有一定的保護作用，但小劑量感染和持續暴露在污染環境所激發的抗體不足以避免病原菌的初期感染和復發。類鼻疽的保護性免疫以細胞免疫爲主。
2．1 嗜中性粒細胞
血液中的嗜中性粒細胞是抗菌免疫的重要機制，對類鼻疽伯克霍爾德菌而言存在較多爭議。我國的研究者用電鏡觀察了模擬菌血症條件下健康人嗜中性粒細胞吞噬和殺滅類鼻疽伯克霍爾德菌的過程。在細菌被吞入的初期，細菌形態完整，吞噬體和菌體大小一致。隨着殺滅功能的進行，吞噬體變得很大，其內的細菌呈鬆散狀，形態結構已發生很大改變。在殺滅作用的後期，於吞噬體內僅見殘留的細菌碎片。這一結果說明健康人的嗜中性粒細胞能夠殺滅類鼻疽伯克霍爾德菌［20］。
2．2 CD4+T 細胞
有研究認爲，抗原誘導的CD4+T細胞免疫反應在感染後期起主要作用［21］。患有類鼻疽的病人，其IgG，IgA和IgM的水平與疾病的嚴重性呈正相關。與局部感染的病人相比，全身浸潤的病人抗體水平更高。類鼻疽與特異性人白細胞抗原(HLA)二類分子存在關聯。HLA二類分子DRBI1602與急性敗血型類鼻疽呈正相關，而DQA1*03與其呈負相關。由於類鼻疽伯克霍爾德菌抗原反射性增強了淋巴細胞增殖和INF-γ的產生，類鼻疽恢復的患者表現抗原特異性的細胞免疫反應。測定類鼻疽伯克霍爾德菌抗原淋巴細胞反應顯示，與曾經患過類鼻疽的人相比，無臨牀症狀的潛伏期患者表現較強的細胞介導的適應性免疫反應。CD4+T細胞產生的INF-γ激活了巨噬細胞，從而使巨噬細胞具有更強的殺菌活性，也就是說，INF-γ增強了巨噬細胞的細胞內殺菌活性。最近的研究表明，類鼻疽伯克霍爾德菌特異的CD4+T細胞在鼠類宿主感染後期抑制病原菌起到重要作用。但對CD4+T細胞在控制病原菌感染方面的重要性仍存在公開的爭議。因爲目前沒有發現HIV和類鼻疽感染之間存在相關性。
2．3 補體系統
衆所周知，補體系統在抗革蘭氏陰性菌感染中發揮着重要的作用。補體系統對革蘭陰性菌外膜的直接損傷被認爲是補體系統殺滅革蘭陰性菌的重要環節，細菌的最終死亡有賴於隨後的一系列生物學過程。類鼻疽伯克霍爾德菌能夠快速和有效的激活補體。補體的激活導致C3補體在細菌表面沉積並進一步調理化。粒細胞和巨噬細胞對類鼻疽伯克霍爾德菌的黏附和吞噬作用依賴於調理素的存在和巨噬細胞膜上表達的補體受體CR1和CR3的參與。莢膜多糖通過減少補體因子C3b的沉積抵禦吞噬作用。但是有資料表明類鼻疽伯克霍爾德菌有抗補體的作用。類鼻疽伯克霍爾德菌能夠抑制補體的細胞溶解酶活性，其他致病菌如包柔螺旋體菌、沙門菌、奈瑟菌以及鏈球菌均有該特性。補體成爲類鼻疽伯克霍爾德菌體內潛藏的場所。補體能夠增強吞噬作用，但有證據表明，類鼻疽伯克霍爾德菌可在吞噬細胞內存活和繁殖，包括巨噬細胞、單核細胞和嗜中性粒細胞，利用多種機制逃避巨噬細胞的殺菌作用和宿主細胞的免疫作用，這些機制包括抵抗人的防禦蛋白和抑制細胞內DNA和蛋白質的合成。超微結構研究發現，病原菌能夠存在於膜結合體特別是吞噬溶酶體，從而能在酸性環境中生存與生長;被吞噬的病原菌能夠阻止吞噬體和溶酶體的融合併在15 min內破壞吞噬體的膜結構，這種現象在類鼻疽感染患者體內也得到證實。當巨噬細胞與大腸桿菌、沙門菌等病原菌作用時，可誘導產生一氧化氮合酶和α-腫瘤壞死因子，但類鼻疽伯克霍爾德菌可阻礙誘生型一氧化氮合酶的表達，並抑制細胞因子的產生，從而產生對抗巨噬細胞的殺菌作用。在感染類鼻疽伯克霍爾德菌的人類組織中，偶爾可見多核鉅細胞和大的巨噬細胞，這可能是由於病原菌在巨噬細胞內的存活，細胞半衰期延長，降低了細胞的殺菌能力。類鼻疽伯克霍爾德菌可誘導蛋白酶依賴的宿主細胞死亡，逃避巨噬細胞的殺菌作用;而細胞死亡伴隨IL-1β和IL-18的釋放。在保護性生物膜中膠囊化的菌落也可延長細菌在靜止狀態的生活週期［21～23］。
2．4 細胞因子
細胞因子在類鼻疽伯克霍爾德菌感染的免疫保護反應中起到重要作用，臨牀研究證明，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)能夠提高重症類鼻疽患者的存活率。糖尿病能夠損害嗜中性粒細胞的趨化、吞噬和殺傷功能。其他風險因素如地中海貧血、酒精中毒、慢性腎功能衰竭等也有相似作用。G-CSF的使用能夠對抗這些不利因素的影響［24］。
促炎症細胞因子γ干擾素(INF-γ)在早期抵禦類鼻疽伯克霍爾德菌感染具有重要作用［25～27］。抑制鼠表達INF-γ，其ID50從5×106降低至2 CFU，而且肝臟細菌數增加8 500倍，脾臟細菌數增加4 400倍。抑制INF-γ內源生成誘導因子IL-12和IL-18表達，增加了同型動物感染模型的死亡率。細胞內感染類鼻疽伯克霍爾德菌主要引起1型T細胞免疫反應(Th1)，產生多種細胞因子，其中INF-γ，IL-12和IL-18最先產生。這些細胞因子能夠增強吞噬和胞內菌的殺傷作用。細胞毒T淋巴細胞和NK細胞等效應細胞在INF-γ的作用下，能促進感染病原菌細胞的凋亡。INF-β能夠促進誘生型一氧化氮合酶的表達，增強巨噬細胞的抗菌活性。另一個重要的促炎症細胞因子腫瘤壞死因子(TNF-α)在類鼻疽伯克霍爾德菌感染的早期免疫也起到重要作用。抵抗巨噬細胞源細胞因子的被動免疫增加了實驗感染鼠的死亡率;類鼻疽患者血清中的INF-γ，IL-12和TNF-α濃度升高。TNF-α啓動子的多態性與類鼻疽感染存在與否及感染嚴重性有關。
3 展 望
儘管關於類鼻疽發病機制有許多較爲詳盡的研究，也有衆多研究者從假定毒力因子及其病原宿主免疫互作方面進行了諸多探討。基因組信息和芯片分子技術工具的採用，該病原菌的分子和細胞致病機制的探索也初見成效。然而從Whitemore發現鼻疽伯克霍爾德菌至今，其感染髮病的每一個過程仍有許多問題尚未探明。未來的研究應着重從以下幾個方面進行:(1)進一步明確鼻疽伯克霍爾德菌對上皮細胞和巨噬細胞的吸附、入侵和細胞內存活機制;(2)進而瞭解細菌傳播的機制;(3)探索細菌如何與免疫系統互作導致疾病暴發的機制，這是開發多功能疫苗的基礎。
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Molecular and Cellular Basis of Pathogenesis of Burkholderia pseudomallei
CAO Wang-bin，HE Ying
(Department of Animal Science ＆ Veterinary Medicine，Hebei Normal University of Science＆ Technology，Hebei Province Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine，Qinhuangdao Hebei，066600，China)
Abstrict:Burkholderia pseudomallei is a potential bioterror agent and the causative agent of melioidosis，a severe disease that is endemic in areas of Southeast Asia and Northern Australia．Studying how the disease is acquired and the host-pathogen interactions involved will underpin understanding of the bacteria．This review presents an overview focused on current knowledge of putative virulence factors and the host-pathogen interactions，led to understanding of the infection process of Burkholderia pseudomallei and effective control strategy．
Key words:Burkholderia pseudomallei;virulence factor;host-pathogen interaction;pathogenesis