6、無重複差異基因分析（edgeR包的使用）

1）簡介

edgeR作用對象是count文件，rows 代表基因，行代表文庫，count代表的是比對到每個基因的reads數目。它主要關注的是差異表達分析，而不是定量基因表達水平。

edgeR works on a table of integer read counts, with rows corresponding to genes and columns to independent libraries. The counts represent the total number of reads aligning to each gene (or other genomic locus).edgeR is concerned with diﬀerential expression analysis rather than with the quantiﬁcation of expression levels. It is concerned with relative changes in expression levels between conditions,but not directly with estimating absolute expression levels.

edgeR作用的是真實的比對統計，因此不建議用預測的轉錄本

Note that edgeR is designed to work with actual read counts. We not recommend that predicted transcript abundances are input the edgeR in place of actual counts.

歸一化原因：

技術原因影響差異表達分析：
1）Sequencing depth：統計測序深度(即代表的是library size)；
2）RNA composition：個別異常高表達基因導致其它基因採樣不足
3）GC content： sample-speciﬁc eﬀects for GC-content can be detected
4）sample-speciﬁc eﬀects for gene length have been detected

注意：edgeR必須是原始表達量，而不能是rpkm等矯正過的。
Note that normalization in edgeR is model-based, and the original read counts are not themselves transformed. This means that users should not transform the read counts in any way before inputing them to edgeR. For example, users should not enter RPKM or FPKM values to edgeR in place of read counts. Such quantities will prevent edgeR from correctly estimating the mean-variance relationship in the data, which is a crucial to the statistical strategies underlying edgeR.Similarly, users should not add artiﬁcial values to the counts before inputing them to edgeR.
個人是不太推薦沒有重複的差異表達分析，因爲畢竟統計學上的p值是爲了證明兩個樣本的差異是真實存在而不是抽樣誤差導致的，
因此每當別人提問的時候, 我個人的建議就是定性看看倍數變化吧. 但是如果真的強行要算p值, 其實也不是不行, edgeR就是一種選擇.

2)、首先安裝edgeR 包

#如果沒有安裝BiocMaRnager則先安裝BiocManager，之後通過BiocManager安裝edgeR包

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
    install.packages("BiocManager")

BiocManager::install("edgeR")

安裝結束之後開始處理文件

3）矩陣構建及差異分析

需要構建2個矩陣：1、表達矩陣；2、分組矩陣( 實驗設計)；

3.1 表達矩陣

3.11 讀取文件

# 首先讀取counts文件之後查看count文件前6行
> rawdata <- read.csv(file = "C://Users/My/Desktop/diff_name",header = T,stringsAsFactors = F)
# 查看讀取的diff_name文件
> head(rawdata)
  X    ensembl_gene_id               gene_id control_W55 test_K54 external_gene_name
1 1 ENSMUSG00000000001  ENSMUSG00000000001.4           7       11              Gnai3
2 2 ENSMUSG00000000003 ENSMUSG00000000003.15           0        0               Pbsn
3 3 ENSMUSG00000000028 ENSMUSG00000000028.15           1        0              Cdc45
4 4 ENSMUSG00000000031 ENSMUSG00000000031.16           0        2                H19
5 5 ENSMUSG00000000037 ENSMUSG00000000037.17           0        0              Scml2
6 6 ENSMUSG00000000049 ENSMUSG00000000049.11          54       33               Apoh

讀取完數據之後我們先預處理一下數據，比如我只想要ensembl_gene_id、control_w55、tese_k54、external_gene_name這幾列，並調整一下順序。

> swap_rawdata <- cbind(rawdata$ensembl_gene_id,rawdata$external_gene_name,rawdata$control_W55,rawdata$test_K54)
> head(swap_rawdata)
     [,1]                 [,2]    [,3] [,4]
[1,] "ENSMUSG00000000001" "Gnai3" "7"  "11"
[2,] "ENSMUSG00000000003" "Pbsn"  "0"  "0" 
[3,] "ENSMUSG00000000028" "Cdc45" "1"  "0" 
[4,] "ENSMUSG00000000031" "H19"   "0"  "2" 
[5,] "ENSMUSG00000000037" "Scml2" "0"  "0" 
[6,] "ENSMUSG00000000049" "Apoh"  "54" "33"
# 得到的這個swap_rawdata是一個matrix，如果想要讓其變爲data frame
> swap_rawdata <- data.frame(swap_rawdata)
# 查看一下是否轉化成功
> head(swap_rawdata)
     ensembl_gene_id external_gene_name control_W55 test_K54
1 ENSMUSG00000000001              Gnai3           7       11
2 ENSMUSG00000000003               Pbsn           0        0
3 ENSMUSG00000000028              Cdc45           1        0
4 ENSMUSG00000000031                H19           0        2
5 ENSMUSG00000000037              Scml2           0        0
6 ENSMUSG00000000049               Apoh          54       33
# 轉化完轉化先存一份csv文件在電腦裏，便於之後用電腦查看
> write.csv(x = swap_rawdata,file = "C://Users/My/Desktop/swap_rawdata.csv")
# 存完之後直接從電腦導入你剛存的文件，這樣做可以避免出現numeric數據框變成factor形式
> swap_rawdata <- read.table("swap_rawdata.csv",header = T,sep = ",")
# 查看
> head(swap_rawdata)
  X    ensembl_gene_id external_gene_name control_W55 test_K54
1 1 ENSMUSG00000000001              Gnai3           7       11
2 2 ENSMUSG00000000003               Pbsn           0        0
3 3 ENSMUSG00000000028              Cdc45           1        0
4 4 ENSMUSG00000000031                H19           0        2
5 5 ENSMUSG00000000037              Scml2           0        0
6 6 ENSMUSG00000000049               Apoh          54       33
> data.class(swap_rawdata[1,1])

3.2 接着構建DGEList對象

這裏因爲已經有rawdata的count文件，因此直接用DGEList()函數就行了，否則要用readDGE()函數

# 首先載入edgeR 包
> library(edgeR)
# 構建DGEList
> group <- 1:2
> y <- DGEList(counts = swap_rawdata[,4:5],genes = swap_rawdata[,2:3],group = group)
# 查看構建完y的信息
> y

查看構建DGElist的運行結果:

DGEList對象主要有三部分：

1、counts矩陣：包含的是整數counts;

2、samples數據框：包含的是文庫(sample)信息。包含 lib.size列：for the library size (sequencing depth) for each sample,如果不自定義， the library sizes will be computed from the column sums of the counts。其中還有一個group列，用於指定每個sample組信息

3、一個可選的數據框genes：gene的註釋信息

第二步：過濾 low counts數據。與DESeq2的預過濾不同，DESeq2的預過濾只是爲了改善後續運算性能，在運行過程中依舊會自動處理low count數據，edgeR需要在分析前就要排除那些low count數據，而且非常嚴格。從生物學角度，有生物學意義的基因的表達量必須高於某一個閾值。從統計學角度上， low count的數據不太可能有顯著性差異，而且在多重試驗矯正階段還會拖後腿。

數據過濾

由於原來的表達量矩陣基因數太大, 可能存在某些基因根本沒有表達, 因此需要預先過濾

> keep <- rowSums(cpm(y)>1) >= 1
> y <- y[keep, , keep.lib.sizes=FALSE]
> y

這部分代碼的意思指的是保留在至少在一個樣本里有表達的基因(CPM > 1)。基因數就從原來的55318變爲15868

標準化

考慮到測序深度不同, 我們需要對其進行標準化, 避免文庫大小不同導致的分析誤差.

edgeR裏默認採用TMM(trimmed mean of M-values) 對配對樣本進行標準化，用到的函數是calcNormFactors

> y <- calcNormFactors(y)

執行結果：

差異表達分析

不同差異表達分析工具的目標就是預測出dispersion(離散值), 有了離散值就能夠計算p值. 那麼dispersion怎麼計算呢? edgeR給了幾個方法

根據經驗給定一個值(BCV, square-root-dispersion). edgeR給的建議是, 如果你是人類數據, 且實驗做的很好(無過多的其他因素影響), 設置爲0.4, 如果是遺傳上相似的模式物種（這裏爲小鼠）, 設置爲0.1 （查詢edgeR的bioconductor包所得）
Simply pick a reasonable dispersion value, based on your experience with similar data,and use that for exactTest or glmFit. Typical values for the common BCV (square-root dispersion) for datasets arising from well-controlled experiments are 0.4 for human data,0.1 for data on genetically identical model organisms or 0.01 for technical replicates.

> y_bcv <- y
# 因爲本次的數據使用的是小鼠的數據，所以使用0.1
> bcv <- 0.1
> et <- exactTest(y_bcv, dispersion = bcv ^ 2)
> gene1 <- decideTestsDGE(et, p.value = 0.05, lfc = 0)
> head(gene1)
> summary(gene1)

執行結果：

由統計結果可知，下調的基因爲816個，上調的基因爲572個

如果覺得覺得基因較多的話，可以上調bcv的值

> y_bcv <- y
> bcv <- 0.2
> et2 <- exactTest(y_bcv, dispersion = bcv ^ 2)
> gene2 <- decideTestsDGE(et2, p.value = 0.05, lfc = 0)
> summary(gene2)

執行結果：

由統計結果可知，下調的基因爲377個，上調的基因爲221個
與之前的結果相比，的確已經減少很多

將結果整理成excel表

# 改一下gene1的名稱
> colnames(gene1) <- "Signifi"
# 組合將所需要的數據組成一個新的data.frame
> results <- cbind(y$genes,y$counts,et$table,gene1)
> head(results)
# 將新生成的results數據框寫成一個excel數據表
> write.csv(x = results,file = "C://Users/My/Desktop/DEresult.csv",row.names = F)

執行結果：

生成的excel表可以將down expressed 和 up expressed基因分開

參考文獻：https://blog.csdn.net/u012110870/article/details/102804557
https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf

6、無重複差異基因分析（edgeR包的使用）

1）簡介

2)、首先安裝edgeR 包

3）矩陣構建及差異分析

3.1 表達矩陣

3.2 接着構建DGEList對象

數據過濾

標準化

差異表達分析

生物信息學習網站參考

Linux服務器硬件情況的查看

利用guppy進行basecalling guppy介紹

Linux文本三劍客之----grep的使用

Linux文本編輯三劍客之---awk的使用

https://yachay.unat.edu.pe/blog/index.php?comment_area=format_blog&comment_component=blog&comment_co

linux以太網驅動總結