使用NCBI進行目的基因的引物設計
全文概述
利用生信工具進行目的基因的引物設計，使用了NCBI進行篩選與設計引物，使用 idtdna對篩選出的DNA進行檢查。本文分享瞭如何篩選出高質量的基因引物，幫助想通過生信進行引物設計的學生、從業者找出合適的基因，畢竟購買引物也比較燒錢，避免設計出的基因質量偏低。
NCBI查找基因
1.查詢目的基因：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=zbed3
備註：這裏需要注意的是，要找到合適的目的基因！如果找智人，一般會是NM開頭
2.選擇其中一個數據連接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001329564.2，選擇Pick Primers
3.進入：
設計-篩選設置
4.根據一些實驗經驗調節一些關鍵參數：
1）Primer Parameters-PCR product size：設置爲75-300
2）Exon/intron selection- Exon junction span：設置必須跨越外顯子（Primer must span an exon-exon junction），避免污染
3） Advanced parameters - Primer Parameters：GC建議在40%-60%之間
5.點擊Get Primers
6.跳轉頁面
7.挑選合適的primer pair，其中product length最好是在150附近（不是絕對）
設計-DNA檢查
8.註冊idtdna進行dna分析，https://sg.idtdna.com/calc/analyzer
9.抽取其中一個primer pair
Primer pair 6
| Sequence (5’->3’) | Template strand | Length | Start | Stop | Tm | GC% | Self complementarity | Self 3’ complementarity | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Forward primer | ACAGCAACACAGAAGACCGT | Plus | 20 | 604 | 623 | 59.82 | 50.00 | 3.00 | 3.00 |
| Reverse primer | CCAGTAAGCTTGCCATTGAGC | Minus | 21 | 749 | 729 | 59.87 | 52.38 | 6.00 | 3.00 |
| Product length | 146 | ||||||||
| Exon junction | 737/738 (reverse primer) on template NM_001115114.1 |
Products on intended target
NM_001115114.1 Danio rerio glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gapdh), mRNA
product length = 146
Forward primer 1 ACAGCAACACAGAAGACCGT 20
Template 604 … 623
Reverse primer 1 CCAGTAAGCTTGCCATTGAGC 21
Template 749 … 729
10.使用idtdna進行篩選
舉例：正旋：ACAGCAACACAGAAGACCGT，反旋：CCAGTAAGCTTGCCATTGAGC
以此使用正旋與反旋填寫入sequence，如圖使用正旋，點擊self-dimer，如果序列結果中，basePairs都小於10，那麼這個引物就算比較好的了，不是自旋產生的。
11.接着正反計算，輸入正反旋，年級HETERO-DIMER,最後點擊CALCULATE，如果序列結果中，basePairs都小於10，那麼這個引物就算比較好的了，不是自旋產生的。
