生物傳感器相關概念簡述
An Overview of Biosensors
一、熒光與化學發光
- 熒光產生的原理
單線態、三線態、振動弛豫、內轉換、體系間跨越
熒光與磷光的區別
- 熒光激發光譜、熒光發射光譜、三維熒光光譜
- 影響熒光量子產率的因素
- 熒光猝滅的類型和機理
Stern-Volmer方程式
- 如何識別熒光與散射光
Rayleigh散射和Raman散射
- 如何利用熒光光譜進行定量分析
熒光定量公式
提高熒光發射強度的方法
- 化學發光原理及常用的液相化學發光體系
- 熒光光譜儀的基本構造
與UV的區別
- 常用的熒光分析方法
直接分析法
間接分析法（猝滅）
FRET（基於FRET原理的分子信標）
熒光各向異性
熒光標記
示蹤與細胞影像
二、生物傳感器
- 生物傳感器的構成
- Bioreceptor（生物接收器）
- Transducer（轉換器）
- Bioreceptor的種類
- 酶 -ase是英文中酶的後綴
Classification of Enzyme酶的種類如下:
Oxidoreductases(氧化還原酶)、Transferases(轉移酶)、Hydrolases(水解酶)、Lyases(裂解酶)、Isomerases(異構酶)、Ligases(連接酶)
酶與底物反應，首先形成過渡態ES：E + Substrate = E*S=E + Product，酶的催化作用可以使反應的活化能下降，催化過程符合Michaelis-Menten方程。反應速率達到最大反應速率一半時的底物濃度，稱爲米氏常數。
當酶的活性中心被佔滿的時候，底物濃度增加，反應速率也不會再增加。
脫氫酶可以催化還原性物質（或稱爲還原態物質Reduced substrate）跟NAD之間的H的轉移，可以把還原性物質氧化。
Reduced substrate + NAD(P)+ =(在脫氫酶作用下)= Oxidized substrate + NAD(P)H + H+
Reduced dye + H2O2 =(peroxidase過氧化物酶)= Oxidized dye + H2O
- 抗體
Immunology with label methods
1. Competitive 競爭法
加入定量的經過酶標記的抗原分子，與未知濃度的抗原分子進行競爭性抗原抗體結合。
2. Sandwich 三明治法
在抗體中，Constant region 稱爲保守區，其氨基酸序列是始終不變的，Variable region可變區的氨基酸序列是可變的，針對不同的抗原，有不同的序列。因此一種抗原對應一種抗體，因爲此處的序列改變會影響到抗體構象，其對於被檢測分子的空間適配性也會發生改變。選擇性從化學根本的原因來說，是空間的適配性，就像鑰匙插到鎖裏面。
- ssDNA（單鏈DNA）
- Molecular Beacon（分子信標）
- Aptamer（核酸適體）
- Synthetic receptor（合成受體）
- Transducer的種類
- 電化學（電位，電流）
- 光學（光吸收，熒光，光干涉，SPR）
光學傳感檢測的量：
1. Absorption
2. Emission
3. Reflection反射
4. Refractive index折射，例如SPR
5. Scattering散射，例如拉曼光譜
- 振盪頻率（QCM）
- 常用的標記方法
常用的標記方法：
- 放射性同位素標記Radioactive Isotopes，例如碘125，除非要求靈敏度特別高，否則不採用
- 熒光標記Fluorescent labels，使用高量子產率的熒光物質標記，可以是有機分子，也可以是量子點
- 化學發光標記Chemiluminescent labels
（以上爲光學方法）
- 電活性物質標記Electroactive labels
- 酶標記Enzyme labels
- 金屬標記Metallic labels（納米金）
（以上爲電化學方法）
三、納米分析化學
納米分析中的信號響應機理
0維材料：particle；1維材料：納米線、納米棒；2維材料：石墨烯，硫化鉬等。
- 納米電分析
基於零維納米材料（納米顆粒particle）的電化學生物傳感器原理
基於零維材料的電化學分析：一是用納米粒子標記生物分子用於電化學傳感（標記方法、電化學免疫分析和DNA檢測）；二是用納米粒子構築電化學界面促進生物分子的電子轉移；三是納米粒子的光電化學。
尺寸效應有兩種：一種是局域表面等離子共振；另一種是光的散射。發生表面等離子共振是不太容易的，因爲光的耦合發生共振，共振需要一定的波長，一定的相位。光照射金納米顆粒，非常容易耦合，因爲是納米金顆粒球形的，所以只要波長合適就可以耦合。光的電場和磁場會引起金屬表面的金自由電子發生振盪，自由電子的振盪也有表面等離子波，但是是侷限在金納米顆粒表面的，因此叫做Local Surface Plasmon Effect（LSPR）。如果光的波長合適，就可以與表面等離子波的頻率一致，就可以達到共振，這束光就會被吸收，就會產生顏色，光被吸收就會有顏色。表面等離子共振能產生多大的吸收，與極化率有關係，而極化率又與金屬表面的介電常數有關係。金的極化率與銀不同，相同直徑的金納米顆粒和銀納米顆粒，兩者的表面等離子吸收完全不同，極化率也會影響到拉曼的散射。
納米金不同的顏色不是完全由於吸收造成，吸收只是一部分，還有一部分是由於光的選擇性散射，這兩部分的疊加效應我們稱之爲消光，Extinction=Scattering+Absorption，所以在測量納米金光譜的時候，縱座標必須是E。對於納米金屬顆粒，縱座標不應該是吸光度，而應該是消光，其由散射和吸收疊加而成。結果圖的座標軸選取方面，物理系的人喜歡橫座標用eV，化學系喜歡用wavelength。
納米金一般由氯金酸還原所得，還原時使用的還原劑其還原性不能太強，若太強則容易生成大顆粒，常用的例如檸檬酸。納米金尺度越小越偏紅，尺度越大越偏藍。明場看到的是通常是吸收引起的，看到的是互補光，這是光的互補性。高錳酸鉀爲什麼是紫紅色的，因爲高錳酸鉀吸收的是黃綠色的光。暗場的光是激發後產生輻射躍遷。
納米材料的特性：一是表面效應，大量的原子暴露在表面，還可以與其他東西配位，表現出高活性以及吸附作用，所以現在很多催化劑都是納米尺度的。吸附是很重要的，如果沒有吸附，就不會對材料的電學性質以及光學性質產生影響；二是體積效應，當尺寸接近德布羅意波長時，顏色會發生變化，例如SPR；三是量子尺寸效應，此時的納米顆粒需要接近波爾半徑，一般在幾個納米，即便是十幾個納米也不行；四是宏觀量子隧道效應。Tunnel effect。隧道掃描顯微鏡STM就是基於此原理。STM的工作原理是，探針與表面的距離越小，隧穿電流約大。
金薄膜的是SPR，金微球的是LSPR。
一維納米材料在電化學分析中的應用
碳納米管的修飾方法
碳納米管，可分爲單層和多層，即Single wall carbon nanotube和Multi wall carbon nanotube。其作用是可以實現直接電子轉移，direct electron transfer，DET。
納米的非標記傳感器，例如碳納米管，只需要吸附bonding，器件的特性曲線就會變化，而且只要bonding一些小分子就會變化，比SPR更靈敏。
甲烷是推電子氣體。納米線的寬度要合適，通過測量納米線吸附氣體後的電阻變化爲原理做傳感。
基於碳納米管的場效應管FET傳感器
以Si作爲基底，將Si基底的表面氧化，氧化後形成很薄的一層二氧化硅，作爲絕緣層，在絕緣層上塗兩個金電極，兩個金電極之間構成源、漏極，源極是source，漏極是drain，在源極和漏極之間是一個碳納米管，由於碳納米管是導電的，因此在施加源漏極電壓後，可以產生電流。
如果在Si基底上再施加一個電壓，這個電壓就是柵極電壓，柵極是gate。施加這個電壓會改變碳納米管的導電特性。場效應管的名稱由來是：因爲Si和碳納米管之間還有絕緣層，所以柵極電壓不是直接加到了碳納米管上，而是對碳納米管施加了電場，這個電場的引入，改變了碳納米管的導電性能。
我們可以通過控制源漏極的電壓和柵極電壓，來測量器件特性曲線Device Characteristics。FET有兩條器件特性曲線：一是改變源漏極電壓，測量源漏極之間的電流，有點類似於電阻，此時的柵極電壓是固定的，不同的柵極電壓下可以有不同的器件曲線；另一種是，改變柵極電壓，測量源漏極之間的電流。
假如該碳納米管是N型的，則電子是主要的載流子，若柵極施加正電場，則會吸引載流子貼合到絕緣層，此時導電能力會增加。假如是P型半導體，若柵極還是施加正電場，則主要載流子就會被排斥，遠離絕緣層，此時導電性能會下降。因此FET可以用於測量該納米材料是P型半導體還是N型半導體。
假設柵極電壓從-40掃描到+40V，源漏極之間的電流逐漸減小，則說明是P型半導體。
- 納米光學分析
納米材料的光學響應機理（LSPR、納米粒子聚集、表面折射率改變）
納米材料在光學領域的應用，真正被醫學接受的，是膠體金（納米金）。納米金表面連接抗體，抗原將納米金抗體與抗體之間完全結合在一起，將納米金由聚集態變爲分散態，顏色發生顯著變化。
納米顆粒也會產生類似於自旋耦合的現象，靠近的納米金顆粒的表面等離子波會相互影響，納米金顆粒之間靠近，則LSPR峯會右移，拉開了又會回到原來的位置，基於此原理髮展出aggregation sensor
半導體量子點的光學特性以及應用
量子點（Quantum Dots）通常以CdSe爲核，CdS或ZnS爲殼的核-殼型納米體，與傳統的有機染料相比，其具有獨特的性質。不同尺寸的量子點會有不同的發光顏色，體積越小，能帶越寬的尺寸效應。納米粒子的尺寸變小，接近波爾半徑，出現顯著的量子尺寸效應，導帶能級向負移動，價帶能級向正移動，能隙增加，能帶藍移。
與有機染料相比，量子點的優勢在於：1.例如和羅丹明分子（Rohdamine）相比，量子點的激發光譜非常寬，很多波長都能使其激發， 同時其發射光譜窄，這是非常好的特性；2.另外，量子的量子產率比較高，例如熒光素（Fluorescein），在不同的波長下有不同的量子產率。而作爲標記而言，量子產率顯然更加明亮；3.量子點能夠抵抗光的漂白，有機染料在強光的照射下會自然漂白。
正是由於以上特性，量子點常用於生物成像，表面借各種各樣的有機官能團或者靶向性的物質。例如，用疏水的改良聚丙烯酸包被量子點，使之與免疫球蛋白G和鏈黴親和素相結合，使其能準確地結合並標記在細胞表面蛋白、細胞支架蛋白和細胞核內的蛋白質上。這種是主動靶向的方法，也可以使用被動靶向的方法，例如，因爲腫瘤組織血管的密度和正常組織不一樣， 其對納米材料的滲透性會好一些，納米材料會自動往這些部位聚集。
爲什麼量子點都是半導體，因爲對於半導體而言，其能帶隨着尺寸的變化會有一些改變：若是非納米狀態的固態半導體bulk solid，是間隔很小的能帶，能帶之間的間隔非常小，幾乎無法分辨，因此感覺上是連續的。處於下面的是價帶，上面的是導帶，價帶一般充滿了電子。價帶與導帶之間的寬度是禁帶寬度。爲什麼叫半導體，就是因爲其禁帶寬度適中。絕緣體的禁帶寬度非常大，電子很難從價帶跳到導帶。金屬的價帶和導帶幾乎是交錯在一起的。因此金屬在常溫下，大量的自由電子可以移動。隨着尺寸減小，構成物體的粒子數減小，最小的時候就是分子能級圖，量子點就介於分子能級圖和固態能級圖之間。隨着尺寸的減小，禁帶會越來越大。
對於宏觀物體，要克服一個勢壘，因此需要做功，要先到山頂，然後下來。對於小尺寸的particle，例如光子，可以直接穿越勢壘。兩個相靠很近的金納米顆粒，若施加電場，當存在Gap的情況下，電子也是可以轉移過去。此處的Gap可以視爲勢壘。
例如，在免疫標記電化學發光中，吡啶釕與電極沒有直接接觸，但是吡啶釕的電子同樣可以轉移到電極上，這就是量子隧穿效應。
四、電化學中的過電位問題
對於分子量較大的物質，若使用普通的電極，也能發生電子傳遞，但是其過電位非常大，overpotential，如圖中的a到a1。過電位是指，實際發生的氧化或還原的電位與其平衡氧化還原電位之間的差距。假設某分子，0.3V就可以還原，因爲其能斯特電位就在0.3V，此處的能斯特電位就是平衡電位，但是實際實驗中我們發現-0.8V才能還原，再例如，氫氣的電極電勢是0，但氫氣的實際還原電位是負的一點多。過電位產生的原因是：一是濃差極化，由於本體溶液擴散不及時，所以電極表面物質濃度迅速降低；二是電化學極化，電子傳遞速度太慢，所以會存在過電位，一般分子越大，過電位越大，因爲分子越大，其電活性中心與電極表面的電子傳遞會變慢。碳納米管的作用，可以降低過電位，從而使得選擇性大大提高，因爲假如要0.6V才能氧化，那麼血液中的很多物質都能氧化。電化學中低電位氧化還原是一種很重要的提高選擇性的方法。往往通過加入電子媒介的方法降低過電位。
對於過電位的處理，可以參考以下例子：葡萄糖氧化酶催化了氧氣跟葡萄糖反應，將葡萄糖氧化，氧氣變成雙氧水。因此可以通過檢測氧氣的衰減或雙氧水的提高，從而間接地定量葡萄糖。另一種體系是：葡萄糖被葡萄糖氧化酶氧化成葡萄糖酸，葡萄糖氧化酶GOX被還原爲還原態的GOX，二茂鐵奪取還原態GOX的電子，從而將還原態的GOX重新變爲氧化態的GOX，因此GOX是沒有改變的，二茂鐵變成還原態的二茂鐵，還原態的二茂鐵可以在電極表面發生電子傳遞，產生氧化電流。可以認爲是二茂鐵代替了氧氣，而二茂鐵的氧化還原在電極表面更加容易檢測，因爲其可逆性非常好。這種方法沒有實現GOX與電極表面的直接電子轉移，是非DET的。因此在該過程中，二茂鐵是電子媒介體。
NADH輔酶催化葡萄糖體系：Glucose + NAD+（氧化態）在葡萄糖脫氫酶（GDH）的作用下，葡萄糖中H會轉移到NAD+上面，所以葡萄糖就會被氧化，葡萄糖變成Glucose（ox），NAD+變成NADH。該反應的電子受體是NAD+。
GOX催化葡萄糖體系：Glucose+ O2在葡萄糖氧化酶（GOX）的作用下，生成Glucose（ox）以及雙氧水。該反應的電子受體是氧氣。
注：葡萄糖脫氫酶GDH，葡萄糖氧化酶GOX。
蛋白質有活性中心，即便蛋白質與電極很好地貼附，但是電活性中心在裏面，因此很難與電子錶面發生直接的電子轉移，除非是納米電極。
五、其他
關於控制納米顆粒的間距，物理學家做的比較精確，而化學裏，因爲在溶液中，所以很難控制這個距離。物理學家可以通過氣相沉積的方法，去做不同間隔距離的納米材料，從而測量其消光光譜。
在合成的分子中，如果有巰基（-SH）就能和金連接。
從發文章的角度，Discovery的東西，不需要檢測濃度很高，也可以發表出來。
CDI Method：連接羥基與氨基
EDC Method：連接羧基與氨基或羧基與巰基
緩衝溶液的導電能力遠遠超過隧穿電流，隧穿電流會被流過緩衝溶液的電流掩蓋。