第二章 微生物的培養與應用
一、培養基
定義：根據微生物對營養物質的不同需求，配製出供其生長繁殖的營養基質——培養基
基本成分：水，碳源，氮源，無機鹽，生長因子，能源（部分物質可同時充當多個成分）
類別：
①固體/液體培養基（凝固劑，常用瓊脂），固體培養基還能培養出肉眼可見的菌落（常用）
②通用/選擇/鑑別培養基，常用於對照實驗中
特殊：乳酸桿菌——添加維生素
黴菌——鹼性
細菌——中性或微鹼性
厭氧微生物——無氧
二、消毒滅菌
Ⅰ 消毒：殺死微生物和部分芽孢
①煮沸消毒法：100℃，煮沸5~6min，可殺死微生物細胞和部分芽孢
②巴氏消毒法：用於不耐高溫的液體，70~75℃煮30min/80℃煮15min，可殺死微生物且營養成分不被破壞
③化學藥劑消毒，如酒精，氯氣
④物理消毒，如紫外線照射30min
Ⅱ 滅菌：殺死微生物和全部芽孢
①灼燒滅菌：接種環，接種針或其他金屬用具，直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒（即外焰），可以迅速徹底的滅菌
②乾熱滅菌：玻璃器皿和金屬用具等，將滅菌物品放入乾熱滅菌箱內，在160~170℃加熱1 ~2h
③高壓蒸汽滅菌：先將滅菌物品放置在盛有適量水的高壓蒸汽滅菌鍋內，將水加熱煮沸，冷空氣徹底排除後將鍋密閉，繼續加熱使氣壓上升，一般在壓力位100kpa，溫度爲121℃持續15~30min。
注意：必須等待壓力錶的壓力降到0才能打開排氣閥，否則可能1、因爲氣壓差導致冷空氣倒灌使器皿破裂2、蒸汽噴出造成傷害
三、牛肉膏蛋白腖固體培養基
製備過程：計算——稱量——溶化——滅菌——倒平板
注意事項：
①稱取牛肉膏用玻棒挑取——牛肉膏比較黏稠
②稱取時動作要迅速，稱後要及時蓋上瓶蓋——牛肉膏和蛋白腖都容易吸潮
③溶化時，將稱好的牛肉膏連同稱量紙一同放入燒杯
④在融化過程中，不斷用玻棒攪拌使其溶解——防止瓊脂糊底而導致燒杯破裂
⑤配置好後進行高壓滅菌+乾熱滅菌
⑥倒平板注意事項
1、右手拿裝培養基的錐形瓶，左手拔出棉塞
2、右手拿錐形瓶，將瓶口迅速通過火焰（殺菌）
3、用左手將培養皿1打開一條稍大於瓶口的縫隙(不是完全打開)，右手倒入培養基，左手立即蓋上皿蓋
4、等待平板冷卻凝固，將平板倒過來放置——Ⅰ使冷凝水不會從皿蓋滴至皿底Ⅱ
四、接種方式
Ⅰ 平板劃線法
原理：逐步稀釋聚集菌種，直至分離成菌落：由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞羣體
注意事項：
1、每次劃線前後必須灼燒接種環
2、每次劃線要打開一條縫隙，從上一次的末尾開始，劃3~5條平行線
3、最後一區的劃線不能與第一區相連
4、全過程在酒精燈旁進行
Ⅱ 稀釋塗布平板法
原理：將菌液進行一系列的梯度稀釋，然後將不同稀釋度的菌液分別塗布道瓊脂固體培養基的表面進行培養。
注意事項：全程在火焰旁操作
壹.系列稀釋操作
1、將分別盛有9mL 無菌水的六支試管滅菌，然後按101~106編號，之後梯度稀釋
2、每次將菌液注入試管後，用手指輕壓橡皮頭，並吹吸三次——使菌液和水充分混勻
3、移液管需要滅菌，操作時試管口和移液管應在離火焰1~2cm處
貳.塗布平板操作
1、每次塗布平板時僅取少量菌液（不超過0.1mL）
2、滅菌塗布器前要取下膠頭，滅菌時將沾有少量酒精的塗布器在火焰上引燃，待引燃後冷卻8~10s
3、塗布時可轉動培養基，使菌液分佈均勻
五、菌種保存
①冰箱保藏：4℃，每3~6個月要轉移培養基
優點：方便
缺點：保存時間不長，容易污染
②甘油管藏：-20℃冷藏箱，3mL甘油館+1mL甘油+1mL菌液
優點：保存時間長
缺點：比較麻煩
六、菌種分離
①篩選菌株
1、根據目的菌對生存環境的需求，到相應的環境中去尋找
P.S：細菌在土壤中佔比70%90%**，在酸鹼度接近中性的潮溼土壤中生長，絕大多數分佈在**距表層38cm的土壤層，因此要鏟去表層土
P.P.S：取土樣使用的工具都要先進行滅菌，但取土樣這一操作不視作無菌操作（常考點）
[2、如果該菌株佔比少，先進行選擇培養（富集培養）]
3、使用選擇培養基進一步培養
②統計菌落數目
採集樣品，並用稀釋塗布平板法，在適宜溫度下培養適宜時間（可計數）
P.S：
細菌：30-37℃，1-2d
放線菌：25-28℃，5-7d
黴菌：25-28℃，3-4d
注意事項：
1、塗布多個平板取平均值
2、一般選擇菌落數30~300的平板計數
3、統計菌落數往往<實際數目。原因：多個細胞連在一起時，只觀察到一個
③設置對照
目的：排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗可信度
注意：一般需要空白對照，也有隨時間變化自成對照的，請仔細分析
七、纖維素酶
①基本概念
纖維素：多糖，葡萄糖組成
纖維素含量較高：棉花，木材，作物
纖維素酶：一種複合酶，至少包括三種組分：C酶，C酶，葡萄糖苷酶
前兩種酶使纖維素分解爲纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解爲葡萄糖
（全 文 背 誦）
②菌種篩選
主要原理：剛果紅可以與像纖維素這樣的多糖物質形成紅色複合物，而不與纖維二糖/葡萄糖反應
鑑別方式：觀察加入剛果紅的培養基是否產生透明圈，透明圈R：內圈菌落R越大，纖維素分解菌效果越好
P.S：在將樣品稀釋塗布到鑑別纖維素分解菌的培養基之前可以先選擇培養（富集培養）
常考點1：塗布平板時加入剛果紅 or 長出菌落後加入剛果紅？
第一種：無需洗去浮色，但生成透明圈的菌種可能是分解剛果紅的
第二種：一定程度上保證篩選精度，但需要用NaCl溶液洗去浮色
常考點2：纖維素分解菌的選擇培養基/鑑別培養基構成
1、選擇培養基（液）
纖維素——主要碳源（不是唯一碳源）
酵母膏，水解酪素——生長因子，碳源、氮源
各種鹽——無機鹽，(調節PH的作用）
2、鑑別培養基（固）
（好像不常考，懶得寫了）
常考點3：確定是否爲纖維素分解菌
在初步的篩選之後，進行發酵產纖維素酶的實驗，可液體/固體發酵
測定方式：對 纖維素酶分解濾紙等纖維素後所產生的葡萄糖 進行定量的測定
小結
培養基這一章知識點比較密集，而且比較雜，我談下個人看法：
1、本章的實驗要點非常多，尤其是培養基和培養菌種的方式，建議對這兩塊單獨記憶，而不是照着書一小節一小節的複習
2、考試中反而是選擇題最頭疼，因爲考一些記不太清的細節，實驗題反倒還好，因爲考察重點會在對照實驗上面
3、某些特殊的定義和數字要重視（比如複合酶，30~300）。物質濃度和量相關的數字基本不考，但大字部分的一定牢記。