DNA甲基化，即在不改變鹼基類型和DNA序列的前提下，在某些鹼基上加上甲基的過程。它屬於表觀遺傳學範疇，主要通過影響基因表達而改變生物體的性狀。基因甲基化的結果，一般是使甲基化位點下游的基因表達量減少。今天在這裏主要總結一下應用在測序中的甲基化檢測方法：重亞硫酸鹽法和TAP法。
1. 重亞硫酸鹽法
1.1 檢測原理
原理：重亞硫酸鹽能夠將C鹼基轉化成U鹼基，而甲基化修飾後的C鹼基不會和重亞硫酸鹽發生反應，能夠在重亞硫酸鹽處理中，一直保持C鹼基的狀態。因此在對測序數據的比對中，但凡檢測到的C鹼基均表明該位置的C爲甲基化修飾過的C。
1.2 兩種建庫方法
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Illumina 公司的 Truseq DNA建庫方法 （先建庫，後轉化）
也就是說，待檢測的DNA樣品首先要按照正常的建庫流程：打斷獲得DNA片段（200bp左右）--> DNA末端修復並加入ploy A尾 --> 加入接頭
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Illumina Truseq DNA建庫試劑盒當中，它所提供的接頭都已經經過甲基化修飾了，因此可以保證接頭上的C還是保持C，不會被轉化成U，從而保證它可以和固定在flowcell上的DNA接頭互補雜交，通過發生橋式PCR反應、成簇進行測序。
這種方法最大的缺點：構建好的文庫使用重亞硫酸鹽處理時，90%以上的DNA鏈會斷掉（傷敵一千自損八百）。因此文庫的豐富度會損失90%以上，同時便要求樣品量足夠高。
這種方法的好處：建庫過程中用的PCR循環數較少，所以它PCR擴增效率不同，引起的文庫不均一程度較低，也就是PCR偏好性低。
- EpiGnome 方法
1.重亞硫酸鹽先處理DNA，把未甲基化的C都轉變成U
。。。
優點：把重亞硫酸鹽處理的過程放在了建庫前，這樣建成的庫的豐富程度會比較高。
缺點：要做較多的PCR循環，這樣PCR產物的擴增均一性不是太好，PCR偏性較大。
Hiseq 2000 /2500 測甲基化文庫的問題和解決方案
對於Illumina的HiSeq2000或者2500平臺上進行測序，如果文庫是 鹼基平衡 的文庫（也就是A/C/G/T四種鹼基的比例各佔25%左右的文庫），測序儀對鹼基的判讀會比較好。
而甲基化的C畢竟佔比不高，這種將正常C轉化成U的方法無疑使最終上機的DNA文庫鹼基不平衡，這樣在使用Hiseq 2000 /2500測序儀來測甲基化文庫的過程中，文庫測序得到的數據質量就很差，並且經過過濾得到的有效數據質量也會較低。實際上機過程中，爲了彌補甲基化文庫的鹼基不平衡，通常會摻入大比例（一般爲30%）的基因組文庫、或者PhiX文庫，來補充較多的C鹼基。
設置內參
由於重亞硫酸鹽對未甲基化的C的轉化效率不是100%（一般99%左右），爲了對實驗的轉化效率進行控制。一般會在轉化實驗中加入1%內參對照品：λDNA(甲基化酶缺陷型的大腸桿菌所生產出來的完全沒有甲基化的DNA) 或 pUC19 DNA(質粒)來看轉化效率。（同樣可以通過用甲基化酶處理過的,CpG島完全被甲基化的DNA）來追蹤甲基化DNA對重亞硫酸鹽轉化的抵抗效果。數據分析（需要做兩次轉換）
測序出來的序列在和基因組進行對比時，直接對比是比對不上的。
-- 把 參考基因組 上所有的C都改成T，和測序序列進行對比
-- 把 參考基因組 上所有的G都改成A，和測序序列進行對比
比對上之後，再尋找reads中的C鹼基，標記他們的座標，這些便是我們尋找的甲基化的C鹼基。
TAPS甲基化測序
TAPS 英文全稱 "TET-assisted pyridine borane sequencing"，TET協助的吡啶硼烷測序。TET(ten-eleven translocation)指的是“10-11轉位酶”，TET酶能夠把甲基化的C鹼基轉化成羧基化的C鹼基。原理：接着在吡啶硼烷作用下把羧基化的C轉化成二氫尿嘧啶（也就是多兩個H原子的U鹼基），二氫尿嘧啶在PCR和測序過程當中，都會識別成T。
可以通過對比轉化前後哪些C鹼基被轉化成了T，就可以知道哪些C是被甲基化了的。
TAPS的假陰性率 2.7%-3.5%，假陽性率0.23%
優點：
- TAPS方法對DNA的破壞很小，可以保持10KB以上的長鏈DNA。
- 只要1ng的DNA量就能建庫，相比重亞硫酸氫鹽的方法少了一千倍（1ug DNA）
- TAPS得到的DNA文庫複雜度高（僅把佔比很小的甲基化C進行了改變，對DNA的天然序列改變很小，鹼基平衡），對Illumina測序儀更加友好，數據質量較高，有效數據量增加
- 可以使用通用的BWA序列比對方法完成序列比對工作（重亞硫酸鹽法得到的數據，因爲大量的C鹼基都被改成了T，所以要用特殊的軟件來分析，例如Bismark軟件）
文章🔗 Bisulfite-free direct detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at base resolution