在上一篇笔记的结尾处，提到了cellranger count这一步，之前几天我一直是用的服务器里128G和200G的内存试着运行这一步，并且限制了cores的数量（64），但是在24小时之内都没有处理完SRR7722937这一个样品的fastq文件（在服务器里跑程序需要设置运行时间）。这次我取消了内存以及cores的数量限制（这时cellranger会耗尽几乎所有的可用内存，大概将近300个G），并且把运行时间的限制从24小时改成了5天：
$ cellranger count \
--id=Tumor937
--transcriptome=/gpfs/home/practice/10_genomics_genome/GRCh38 \
--fastqs=/gpfs/home/practice \
--sample=SRR7722937
--expect-cells=10000
这次的尝试成功的跑完了一个样品，总共运行时间为2天8个小时。打开log文件可以看到程序运行过程中记录了很多条记录，大概有上百行记录，在记录的最后几行，会出现运行的总结，说明你的cellranger count运行成功：
Outputs:
- Run summary HTML: /gpfs/home/practice/Tumor937/outs/web_summary.html
- Run summary CSV: /gpfs/home/practice/Tumor937/outs/metrics_summary.csv
- BAM: /gpfs/home/practice/Tumor937/outs/possorted_genome_bam.bam
- BAM index: /gpfs/home/practice/Tumor937/outs/possorted_genome_bam.bam.bai
- Filtered gene-barcode matrices MEX: /gpfs/home/practice/Tumor937/outs/filtered_gene_bc_matrices
- Filtered gene-barcode matrices HDF5: /gpfs/home/practice/Tumor937/outs/filtered_gene_bc_matrices_h5.h5
- Unfiltered gene-barcode matrices MEX: /gpfs/home/practice/Tumor937/outs/raw_gene_bc_matrices
- Unfiltered gene-barcode matrices HDF5: /gpfs/home/practice/Tumor937/outs/raw_gene_bc_matrices_h5.h5
- Secondary analysis output CSV: /gpfs/home/practice/Tumor937/outs/analysis
- Per-molecule read information: /gpfs/home/practice/Tumor937/outs/molecule_info.h5
- Loupe Cell Browser file: /gpfs/home/practice/Tumor937/outs/cloupe.cloupe
Waiting 6 seconds for UI to do final refresh.
Pipestance completed successfully!
Saving pipestance info to Tumor937/Tumor937.mri.tgz
打开我们在cellranger count代码里设置的文件夹Tumor937，里面有以下文件：
$ ll
total 4820
-rw------- 1 fy04 fy04 267 Aug 4 20:35 _cmdline
-rw------- 1 fy04 fy04 48206 Aug 4 20:35 _filelist
-rw------- 1 fy04 fy04 725168 Aug 4 20:35 _finalstate
-rw------- 1 fy04 fy04 655 Aug 2 12:01 _invocation
-rw------- 1 fy04 fy04 5 Aug 2 12:01 _jobmode
-rw------- 1 fy04 fy04 246834 Aug 4 20:35 _log
-rw------- 1 fy04 fy04 46606 Aug 2 12:01 _mrosource
drwx------ 5 fy04 fy04 8192 Aug 4 20:35 outs #重点关注这个文件夹
-rw------- 1 fy04 fy04 324837 Aug 4 20:35 _perf
drwx------ 5 fy04 fy04 8192 Aug 4 20:34 SC_RNA_COUNTER_CS
-rw------- 1 fy04 fy04 12160 Aug 4 20:35 _sitecheck
-rw------- 1 fy04 fy04 2 Aug 2 12:01 _tags
-rw------- 1 fy04 fy04 51 Aug 4 20:35 _timestamp
-rw------- 1 fy04 fy04 3164754 Aug 4 20:35 Tumor937.mri.tgz
-rw------- 1 fy04 fy04 36 Aug 2 12:01 _uuid
-rw------- 1 fy04 fy04 102558 Aug 4 20:35 _vdrkill
-rw------- 1 fy04 fy04 61 Aug 2 12:01 _versions
再打开“outs”文件夹：
$ ll
total 3264857
drwx------ 6 fy04 fy04 8192 Aug 4 20:35 analysis
-rw------- 1 fy04 fy04 27898707 Aug 4 20:35 cloupe.cloupe #这个文件可以使用Loupe Cell Browser软件打开
drwx------ 3 fy04 fy04 8192 Aug 4 20:35 filtered_gene_bc_matrices
-rw------- 1 fy04 fy04 7247168 Aug 4 16:04 filtered_gene_bc_matrices_h5.h5 #过滤后的基因-barcode矩阵，HDF5格式
-rw------- 1 fy04 fy04 684 Aug 4 20:34 metrics_summary.csv #csv格式的结果总结
-rw------- 1 fy04 fy04 105930133 Aug 4 17:47 molecule_info.h5 #之后如果需要aggr整合几个单细胞测序的样品，这个文件是aggr步骤的输入文件
-rw------- 1 fy04 fy04 3182359671 Aug 4 15:59 possorted_genome_bam.bam #比对到基因组和转录本上的reads，并且带有barcode注释信息
-rw------- 1 fy04 fy04 3949040 Aug 4 16:00 possorted_genome_bam.bam.bai #possorted_genome_bam.bam的索引文件
drwx------ 3 fy04 fy04 8192 Aug 4 20:35 raw_gene_bc_matrices #没有过滤的基因-barcode矩阵，包括所有的barcode
-rw------- 1 fy04 fy04 12085113 Aug 4 16:02 raw_gene_bc_matrices_h5.h5
-rw------- 1 fy04 fy04 3530757 Aug 4 20:34 web_summary.html #网页版的运行结果总结，可以使用任何一个浏览器查看
解读cellranger count的输出文件
（1）web_summary.html文件
一旦cellranger count运行完毕，你可以通过这个文件在浏览器里查看你的结果总结。你也可以使用Loupe Cell Browser软件查看“outs”文件夹里的.cloupe文件。下面这个截屏就是总结，里面记录了测序质量和检测到的细胞的一些特征值。包括检测到的细胞数量，每个细胞的平均reads数，每个细胞检测到的平均基因数（上方的绿色的三个数字）。右面的曲线图显示的是barcode的计数分布，以及哪些barcode对应的相关细胞。Y轴是map到每一个barcode的UMI的计数数值，X轴是对应到这个数值的barcode的数量。这条曲线要有一个急剧下降的趋势才是好的结果，说明细胞barcode在细胞和“空样品”间的差异非常明显。这个曲线图下面的“Fraction reads in cells”这一项比例需要大于70%，说明数据才是质量好的。
上面这个网页的左上角，有一个“ANALYSIS”的选项，点开看，会出现下面这个页面：
这个页面里包括以下几个部分：
（1）t-SNE降维分析
（2）自动生成的聚类分析（根据表达谱里相似表达的基因）
（3）一个差异基因列表，是根据自动生成的聚类来生成的差异基因
（4）一个测序饱和度的曲线
（5）每个细胞里测得的基因数量的曲线
上面图里左边的图是一个二维的t-SNE，每一个点就是一个细胞，根据细胞里含有的UMI数量来区分颜色。这张图也说明了细胞内RNA含量，也通常与细胞大小有关。红色的点代表这个细胞有着更多的RNA含量。在这个座标系里，两个离得很近的点有着更为相似的基因表达模式（相比于两个离得较远的点）。
而上面的右边的是一个聚类的图，你可以通过改变右上角的clustering type，来改变聚类的参数：
这个页面的中部的表就是差异基因列表：
再往下两张图就是测序饱和度（通常也指示文库的复杂度），以及平均每个细胞里测得的基因，这两张图都可以说明测序深度：
（2）bam文件
在“outs”文件夹里，有一个bam文件，是根据我们的fastq文件生成的：
$ samtools view possorted_genome_bam.bam | head -5
SRR7722937.377377 16 1 10232 255 4S94M * 0 0 TTTTCCCTATCCCTAACCCTAACCCTATCCCCTTACCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCTACCCCAACC .<.<..<<...<.<...G<...A.<....AGG<.GGGGA<.<GGGG<<GGGGGGGIGGG<GGA<.<AAA.<<GA<A<<AGAAA<GA<<..<.<..<AG NH:i:1 HI:i:1 AS:i:72 nM:i:10 RE:A:I BC:Z:TTTCATGA QT:Z:GGGGGIII CR:Z:CTTACCGAGTGTACCT CY:Z:GGGGGIIIIIIIIIII CB:Z:CTTACCGAGTGTACCT-1 UR:Z:TTTCCATCGT UY:Z:IIIIIIIIIG UB:Z:TTTCCATCGT RG:Z:Tumor937:MissingLibrary:1:HKMNCBCXY:1
SRR7722937.10911097 256 1 11201 0 1S97M * 0 0 GGCTTGCTCACGGTGCTGTGCCAGGGCGCCCCCTGCTGGCGACTAGGGCAACTGCAGGGCTCTCTTGCTTAGACTGGTGGCCAGCGCCCCCTGCTGGC .AG...GAGGIIGGGGGGGGIGGGGIIIIGGGGGIIIIIIIIGGGIGGIGGGIIIIIGIAGAAGAAGGGGGGGGIGGGGGGG<<.AAAGGIGAGAAA< NH:i:5 HI:i:2 AS:i:93 nM:i:1 RE:A:I BC:Z:ACGTCCCT QT:Z:GGGGGIII CR:Z:CACCACTGTCCATGAT CY:Z:GGGGGIIIIGIIIIII CB:Z:CACCACTGTCCATGAT-1 UR:Z:GAGCGCGGGC UY:Z:IIIIIIIIII UB:Z:GAGCGCGGGC RG:Z:Tumor937:MissingLibrary:1:HKMNCBCXY:1
SRR7722937.27657393 256 1 11208 0 98M * 0 0 CACGGTGCTGTGCCAGGGCGCCCCCTGCTGGCGACTAGGGCAACTGCAGGGCTCTCTTGCTTAGAGTGGTGGCCAGCGCCCCCTGCTGGCGCCGGGGC <.A...7A..<<.<GGG.G<AAAGGGIIIGGIIIGIGAA<GG.GGAGGGGGGGGIGGIIIGGAGG.<GGGGAGAAGAGGI<AAAGGAGGGAAA.<A.. NH:i:5 HI:i:3 AS:i:96 nM:i:0 RE:A:I BC:Z:GAAGGAAC QT:Z:GGGGGIII CR:Z:AGTGAGGGTCAGGACA CY:Z:GGGGGIIIIIIIIIII CB:Z:AGTGAGGGTCAGGACA-1 UR:Z:CAGAACACCA UY:Z:IIIIIIIIII UB:Z:CAGAACACCA RG:Z:Tumor937:MissingLibrary:1:HKMNCBCXY:1
SRR7722937.33049902 256 1 11285 0 98M * 0 0 GCCCCCTGCTGGCGCCGGGGCACTGCAGGGCCCTCTTGCTTACTGTATAGTGGTGGCACGCCGCCTGCTGGCAGCTAGGGACATTGCAGGGTCCTCTT AGAGAA<AG.<AA.AGGGGGIGGGGGGGGGGGGGIGGIIGIIGGG<<AGGGAGGGGGAGGGAG<AGGGGGGIGG.GAGAAAA.GGGG.AGGGGGAA.G NH:i:5 HI:i:2 AS:i:96 nM:i:0 RE:A:I BC:Z:GAAGGAAC QT:Z:GGGGGIII CR:Z:ATTACTCTCCCTTGTG CY:Z:GGGGAIIIIIIIIIII CB:Z:ATTACTCTCCCTTGTG-1 UR:Z:CAATATCCCC UY:Z:IGGGIIIIII UB:Z:CAATATCCCC RG:Z:Tumor937:MissingLibrary:1:HKMNCBCXY:1
SRR7722937.33235779 256 1 11292 0 97M1S * 0 0 GCTGGCGCCGGGGCACTGCAGGGCCCTCTTGCTTACTGTATAGTGGTGGCACGCCGCCTGCTGGCAGCTAGGGACATTGCAGGGTCCTCTTGCTCAAA GGGA...<A<<AGGGGGGAGAGGAGGIIIGIIIIGGGIGGIIIIIIIIGIGGIGGGGAGGGGGGIGGAGGA<GGGGGGGGGGI<GGGGGIIIAAGGG. NH:i:6 HI:i:3 AS:i:95 nM:i:0 RE:A:I BC:Z:GAAGGAAC QT:Z:GGGGGIII CR:Z:TGCCCTAGTAGTAGTA CY:Z:GGGGAIIIIIGGGIII CB:Z:TGCCCTAGTAGTAGTA-1 UR:Z:GTCAGAAGTG UY:Z:IIIIIIIIII UB:Z:GTCAGAAGTG RG:Z:Tumor937:MissingLibrary:1:HKMNCBCXY:1
这个bam文件有25列，前11列是标准的bam文件的内容，后面的14列是cellranger count生成的bam文件特有的，这25列分别是：
（3）矩阵文件
运行cellranger count后会自动生成的二级分析结果，但是一般来说，我们通常是拿到基因表达矩阵后，自己在R里进行后续的分析。
参考文章：https://davetang.org/muse/2018/08/09/getting-started-with-cell-ranger/
在“outs”文件夹里，有一个名为raw_gene_bc_matrices的文件夹：
#包含3个文件：
$ tree
.
└── GRCh38
├── barcodes.tsv
├── genes.tsv
└── matrix.mtx
这3个文件你可以在R里用DropletUtils包直接加载，生成一个SingleCellExperiment对象：
> BiocManager::install("DropletUtils")
> library("DropletUtils")
> sce <- read10xCounts('raw_gene_bc_matrices/GRCh38/')
> sce
class: SingleCellExperiment
dim: 33694 737280
metadata(1): Samples
assays(1): counts
rownames(33694): ENSG00000243485 ENSG00000237613 ...
ENSG00000277475 ENSG00000268674
rowData names(2): ID Symbol
colnames: NULL
colData names(2): Sample Barcode
reducedDimNames(0):
spikeNames(0):
altExpNames(0):
barcodeRanks函数可以把barcode按照总UMI计数来排序：
> br.out <- barcodeRanks(counts(sce))
> library("dplyr")
> br.out.df <- as.data.frame(br.out)
> br.out.df$barcode <- colData(sce)$Barcode
> br.out.df$knee <- br.out@metadata[["knee"]]
> br.out.df$inflection <- br.out@metadata[["inflection"]]
> br.out.df %>%
filter(rank <= 10) %>%
arrange(rank)
rank total fitted barcode knee inflection
1 1 40819 NA CAGGTGCAGCGCTTAT-1 2843 1282
2 2 39401 NA AACTCAGGTTACGGAG-1 2843 1282
3 3 38740 NA CTGATAGTCACCAGGC-1 2843 1282
4 4 36129 NA TTAACTCAGACACTAA-1 2843 1282
5 5 34162 NA GTATCTTCATGCTAGT-1 2843 1282
6 6 33527 NA TTCTCAATCGTACGGC-1 2843 1282
7 7 32814 NA CTCGTACAGCACGCCT-1 2843 1282
8 8 31075 NA ATGTGTGGTCTGGTCG-1 2843 1282
9 9 30447 30753.25 CTCGAGGTCGCGATCG-1 2843 1282
10 10 30439 29994.15 AACCGCGCAGACGCCT-1 2843 1282
我们可以自己画一个barcode vs UMI的点图，就像网页版结果总结里的曲线图那样：
> library(ggplot2)
> x_knee <- br.out.df %>% filter(br.out.df$total > br.out.df$knee) %>% arrange(total) %>% select(rank) %>% head(1)
> x_inflection <- br.out.df %>% filter(br.out.df$total > br.out.df$inflection) %>% > arrange(total) %>% select(rank) %>% head(1)
> padding <- length(br.out$rank) / 10
> p1 <- ggplot(br.out.df, aes(x = rank, y = total)) +
geom_point() +
scale_x_log10() +
scale_y_log10() +
theme_bw() +
theme(axis.text = element_text(size = 10),
axis.title = element_text(size = 14),
title = element_text(size = 16)) +
geom_hline(yintercept = br.out$knee, linetype = 2, colour = "dodgerblue") +
geom_hline(yintercept = br.out$inflection, linetype = 2, colour = "forestgreen") +
labs(x = "Rank", y = "Total", title = "Barcode Rank vs Total UMI") +
annotate("text", label = paste0("Knee (", x_knee, ")"), x = x_knee$rank + padding, y = br.out.df$knee, size = 5) +
annotate("text", label = paste0("Inflection (", x_inflection, ")"), x = x_inflection$rank + padding, y = br.out.df$inflection, size = 5)
> p1
NOTE：我运行的cellranger版本是2.2的，现在最新版已经是cellranger3了，所以结果部分可能会有些出入。