illumina二代測序平臺特點：基於可逆終止的、熒光標記dNTP，實現邊合成、邊測序的工作
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1. 文庫製備
DNA文庫的定義：所謂的DNA文庫，實際上是許多個DNA片段，在兩頭接上了特定的DNA接頭。
DNA文庫的特點：
- 中間插入的DNA片段：是未知的各式各樣的DNA片段，也正是測序儀要檢測的序列片段
- 接頭序列：是人工特地加上去的，其序列是已知的
如何製作DNA文庫：
基因組DNA用超聲波打斷（也可以用通過酶切的方法）獲得短的DNA片段，其粘性末端使用T4-DNA聚合酶補成平末端，然後用klenow酶在3'端加上polyA鹼基（方便接頭嫁接到DNA片段），最後，連接酶將特定的接頭連接上去。連接好接頭的DNA片段混合物，我們稱爲文庫。
2. 成簇反應
瞭解flowcell
flowcell（流動池）爲一個載玻片大小的芯片，裏面做了8條通道，通道的內表面做了專門的化學修飾：主要是用2種寡核苷酸（oligo）通過“共價鍵”種在玻璃表面-在flowcell通道有液體流動時不會輕易沖掉，這2種寡核苷酸（oligo）後面會和測序DNA文庫的接頭序列相互互補。
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1）文庫片段附着到“flowcell上的oligo”
DNA文庫兩頭的序列和芯片上的引物鹼基互補，因此可以通過氫鍵力互補雜交。待測序的DNA片段通過氫鍵力與第一種oligo配對從而固定在flowcell上。
2）被文庫片段附着的oligo延伸出互補的DNA鏈
加入DNA聚合酶和dNTP，flowcell上的oligo做引物，以文庫片段爲模版，合成出一條全新的DNA鏈（和原來的文庫片段序列完全互補）
3）沖走文庫片段
加入NaOH鹼溶液，破壞氫鍵力，模版鏈（文庫片段）被沖走，只剩下與芯片通過共價鍵連接的DNA鏈
4）通過“橋式PCR”將序列信息複製到第2種oligo
加入中性液體，中和鹼液，創造可以產生氫鍵力的環境。
此時，第一種oligo所在DNA鏈上的自由端，會通過成橋的方式和flowcell上的第二種oligo互補配對（形成“單鏈橋”）。我們加入聚合酶和dNTP，聚合酶就沿着第二個oligo合成出一條新的鏈來（形成“雙鏈橋”）。
5）DNA鏈線性化
加入NaOH鹼溶液，破壞氫鍵力，“雙鏈橋”解開（兩個單鏈被固定在flowcell）
6）重複“橋式PCR”
再加入中性液體，中和鹼液。DNA鏈的遊離末端又和flowcel上新的oligo成橋，再加酶和dNTP，在尚未被佔用的oligo上合成新的DNA鏈。
連續重複以上過程，DNA鏈的數量以指數方式增長
7）形成測序鏈
多次橋式PCR完成之後，實現了DNA文庫序列在flowcell上的成倍擴增（實則是爲了放大測序階段的熒光信號）
後面要把合成的雙鏈，變成可以測序的單鏈
方法：把反義鏈上的特定基團切斷，即斷開了反義鏈與oligo的連接，然後用鹼溶液沖洗，被切斷了的DNA鏈被沖掉，只留下通過共價鍵連接的正義鏈。
同時，DNA鏈的3'端被封鎖，以防止與oligo的非特異結合。
3. 測序階段
瞭解 可逆終止、熒光標記的dNTP：
- 熒光標記的dNTP：不同鹼基的識別信號（4種dNTP，每一種上面標的熒光素都不一樣）
阻斷基團：通過控制 3'羥基，控制鹼基的合成節奏
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1）read1讀取
溶液狀態：加入中性溶液，使其適應測序階段。
所需原料：加入read1測序引物，熒光標記的dNTP，DNA聚合酶
測序過程：
- 合成一個鹼基：根據鹼基互補的原理，DNA聚合酶將正確的dNTP合成到新的鏈上，合成一個鹼基後即停止
- 激光掃描：用溶液把多餘的dNTP和酶沖掉，然後激光掃描，根據發出來的熒光判斷它是那個鹼基，根據鹼基互補的原則，反推模版鏈上的鹼基
- 切掉熒光基團和阻斷基團：加入化學試劑，把疊氮鹼基和旁邊標記的熒光基團切掉（暴露出3'羥基）
- 加入新的dNTP和酶：又延長一個鹼基，把多餘的酶和dNTP沖掉，激光掃描判斷鹼基類型
- 重複以上過程，把上百個鹼基讀出來（循環的次數取決於讀長）
- read1讀完之後，讀段產物會被鹼液沖洗掉
2）讀 index1 序列
因爲測序儀的測序通量很大，一個樣本用不到幾百萬條DNA，因此常常多個樣本的DNA文庫混在一起在同一條lane測序。而每一個樣本，都有一個特定的索引序列相互區分（也就是我們常說的index序列）。
- 加入index1引物，與模版鹼基互補雜交
- 與reads1的判讀過程類似，加入熒光標記的dNTP和DNA聚合酶判讀鹼基，讀完後用鹼液沖洗掉
3）讀 index2 序列
- 3'端解除封鎖
- 正義鏈摺疊結合到flowcell上的第2個oligo（形成“單鏈橋”）
- 加入熒光標記的dNTP和DNA聚合酶，讀取index2
4）讀read2序列
形成反義鏈：
index2讀完之後，聚合酶繼續延伸，形成雙鏈橋
然後加入鹼液將DNA雙鏈線性化
正義鏈上的特定基團被切除並洗掉，只留下反義鏈
加入read2的測序引物，與reads1的讀取一樣，重複測序步驟
4. 數據分析
測序獲得的數百萬個讀段序列都通過 index序列 分離歸類到對應的樣本。
具有相似延伸鹼基的reads被聚類在一起，正向和反向reads配對形成連續序列，它們與參考基因組比對，用於突變識別（variant identification）
