前言
2021年新鮮出爐的歐易/鹿明生物合作客戶復旦大學環境科學與工程系鄭正教授課題組在Journal of Hazardous Materials期刊發表的題爲 “Biological toxicity of fresh and rotten algae on freshwater fish: LC50, organ damage and antioxidant response ”的研究成果，通過LC-MS非靶向代謝組學研究方法，檢測了腐爛藻類溶液（RAS）的組成成分和其中的毒性物質，探究了富藻水體對魚類的致死機理。通過16S rRNA測序，發現經新鮮藻類溶液（FAS）和腐爛藻類溶液（RAS）處理後魚類腸道微生物多樣性和豐度的顯著差異，探討了由微生物的差異導致腸道微生物的失衡，炎症、吸收功能障礙，甚至魚類死亡等問題。該研究爲藻類毒性的相關研究提供了依據。
中文標題：新鮮藻類和腐爛藻類對淡水魚的生物毒性：半數致死濃度、器官損傷和抗氧化反應
研究對象：草魚，鯽魚，鰱魚
發表期刊：Journal of Hazardous Materials
影響因子：9.038
發表時間：2021年
合作單位：復旦大學環境科學與工程系
運用歐易/鹿明生物技術：LC-MS非靶代謝組學(由鹿明生物提供技術支持) 、16S rRNA測序(由歐易生物提供技術支持)
研究背景
近幾十年來，富營養化導致的有害藻類大量繁殖使淡水生態系統中的生物被有毒細胞和溶解的毒素包圍。這些生物不僅受到攝入藍細菌和藻類毒素的威脅，還受到相關水污染的影響。與陸生動物相比，水生生物更容易受到有害生物和藻類毒素的影響，尤其是在水生食物網中處於較高營養水平的魚類。有毒藍藻降解過程中，藻細胞壁破裂後，毒素等物質釋放到水中。這導致微囊藻毒素濃度增加，對魚類有毒。藻毒素在浮游動物、貽貝、甲殼類動物和魚類等水生生物中累積，並可轉移到高等脊椎動物體內，具有潛在的致死和亞致死效應。
先前的研究主要都集中在單一物質對水生生物的毒性上，很少進行FAS和RAS的毒性研究。本文研究了FAS和RAS的組成和毒性，觀察了FAS和RAS對魚類的器官損傷，抗氧化反應和腸道微生物的影響，爲藻類毒性及其對水生生物危害相關領域的研究提供依據。
研究思路
研究方法
1.實驗材料
新鮮藻類來自於太湖，腐爛藻類由新鮮藻類經超聲、密封降解15天后過濾而得。實驗對象爲草魚、鯽魚和鰱魚，均來自於太湖，在實驗室淡水養殖兩週。每種魚類分爲新鮮藻液組（FAS組）和腐爛藻液組（RAS組）。通過急毒性實驗，對三種魚在藻類溶液中的安全濃度進行比較，將草魚選爲研究對象進行後續實驗。
2.組學分析
LC-MS非靶向代謝組學實驗(由鹿明生物提供技術支持) ，16S rRNA測序 (由歐易生物提供技術支持)
3.檢測方法
（1）細胞密度檢測：檢測FAS和RAS的毒性；
（2）鏡檢：觀察受試魚的器官損傷；
（3）抗氧化檢測：通過檢測SOD，CAT，GSH和MDA來評估有機污染物對草魚的損害。
研究結果
1.FAS和RAS的組成和毒性
在本研究中，作者研究了FAS和RAS的組成和毒性。通過LC-MS非靶向代謝組分析RAS的組成，結果表明RAS的組成主要包括有機酸、酮類、多肽類、酯類、酚類、氨基酸類和代謝中間產物。其中微囊藻毒素-LR (MC-LR)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二異辛酯(DOP)和三苯基氧化膦(TPPO)具有生態毒性。另外，DBP和DOP是增塑劑的常見成分，對水生生物具有急毒性。
在本研究中，RAS中的黃麴黴毒素B1、嘔吐毒素和玉米赤黴烯酮的濃度分別爲0.543、9.901和14.15 µg/L，而黃麴黴毒素B1對鮎魚的半數致死濃度（LC50）爲9.5-13.3 mg/kg。本研究黃麴黴毒素B1的濃度低於該LC50值，表明魚的死亡是由多種有毒物質產生的有害作用引起的。
2.FAS和RAS對魚類死亡率的影響
圖1爲FAS處理組和RAS處理組的急毒性實驗，通過相應的藻細胞密度來估計FAS和RAS的毒性。作者分別計算了處理12小時、24小時、48小時、72小時和96小時後的死亡率。鯽魚、草魚和鰱魚的死亡率隨着相應的細胞密度而增加。此外，當細胞密度低於7.21 × 1011個細胞/升時，死亡率也隨着處理時間的延長而增加。
圖1 | 三種魚類在FAS和RAS中的死亡率
（A）鯽魚、草魚和鰱魚在新鮮藻液中死亡率、處理時間和藻細胞密度之間的關係。
（B）鯽魚、草魚和鰱魚在腐爛藻液中死亡率、處理時間和藻細胞密度之間的關係。
半數致死濃度是受試生物對有毒物質敏感性的指標，濃度越低則毒性越大，三種魚的RAS的半數致死濃度值都比FAS低一個數量級，表明RAS的毒性更高（圖2）。隨着時間的增加，FAS的半數致死濃度變化比RAS更顯著。作者認爲可能的原因是魚對RAS中有毒物質的耐受性增加。此外，RAS中的有毒物質可能會隨着時間的推移而分解，導致實驗後期毒性增加較慢。而新鮮的藻細胞在細胞死亡後不斷分泌代謝產物並釋放有毒物質，導致後期毒性顯著增加。
圖2 | FAS組和RAS組不同時間與半數致死濃度的多重擬合關係
（A-C）鯽魚、草魚和鰱魚在新鮮藻液中不同處理時間和半數致死濃度的多重擬合關係。
（D-F）鯽魚、草魚和鰱魚在腐爛藻液中不同處理時間和半數致死濃度的多重擬合關係。
3.FAS和RAS對草魚器官的影響
作者通過顯微鏡，透射電鏡觀察了FAS和RAS對草魚器官的影響。結果表明，與對照組相比， FAS組的魚鰓中可觀察到充血，並且在鰓絲之間發現藻類菌落，尤其是在鰓頂部。因此，藻類細胞的粘附嚴重影響魚的呼吸，從而導致魚的死亡。對於RAS組，鰓上沒有觀察到藻類，但整個鰓上出現了嚴重的出血和鰓絲粘連，導致魚的窒息。研究發現FAS和RAS對魚類的毒性機制不同。
對腸道的觀察表明，藻類可以通過攝入進入魚的腸道。在RAS組中發現了腸的組織損傷和出血。同時，RAS中的一些有機物可能會對魚類的腸粘膜和細胞結構造成損傷，導致腸道損傷或出血。
圖3 | 顯微鏡下草魚鰓和腸的照片
（A&B）對照組的鰓及其圓圈部分放大圖像；
（C&D）FAS組中X5組的鰓及其圓圈部分放大圖像；
（E&F）RAS組中F5組的鰓及其圓圈部分放大圖像；
（G）對照組的腸；
（H）FAS組中X5組的腸；
（I）RAS組中F5組的腸。
經透射電鏡觀察，發現FAS和RAS均對鰓細胞造成嚴重損傷，主要表現爲細胞變形、內部結構破壞、細胞線粒體嵴斷裂、自體溶酶體增加、細胞間物質增生、細胞覈收縮或壞死。鰓細胞結構的變化會導致功能退化，這反過來將削弱魚類從水中吸收溶解氧的能力，並加速魚類的缺氧死亡。
圖4 | FAS組和RAS組的魚鰓透射電鏡圖像(×10000)
（A）un:核；pv:胞質空泡；is:細胞間物質；iv:質膜內陷；cv:胞質液泡；om:外質膜；
（B）cv:細胞質液泡；m:線粒體；ly:溶酶體；o:成癮滴；sg:分泌泡。
另外，作者在RAS組的魚肚中發現寄生蟲，觀察到膽囊破裂。而FAS組中魚的腹部是正常的，但魚的肝臟和鰓呈暗紅色，在鰓上發現小瓜蟲。研究觀察表明，FAS和RAS不僅通過器官損傷和呼吸系統破壞導致魚類直接死亡，還通過增加疾病感染率導致其間接死亡。
圖5 | FAS組和RAS組的死魚解剖圖
（A&B）RAS組的F5組；
（C&D）RAS組的F4組；
（E&F）FAS組的X5組；
（G&H）FAS組的X4組。
4. 不同處理時間FAS和RAS對草魚氧化應激反應的影響
作者研究分析了FAS和RAS不同處理時間（1天、3天、5天、10天和15天）後草魚的抗氧化反應。SOD在第5天達到最高值，顯著高於其他時間，隨後呈下降趨勢。CAT與SOD變化趨勢相似。GSH變化明顯，第一天達到最高值。每次處理的值隨着處理時間的增加而降低，並顯著高於對照組。表明FAS和RAS引起草魚氧化應激，抗氧化防禦被激活以清除體內過量的氧自由基。
MDA含量在第一天達到最高值，並且高於其他時間。MDA濃度隨着時間的延長而降低，表明氧化損傷隨着抗氧化防禦系統的激活而降低。SOD、CAT、GSH和MDA的變化證明了草魚的抗氧化防禦是由FAS和RAS誘導的。同時，該值隨時間而變化，表明抗氧化反應是時間依賴性的。
圖6 | 不同FAS和RAS處理天數對草魚氧化應激反應的影響
(A)CAT過氧化氫酶；
(B)GSH谷胱甘肽；
(C)SOD超氧化物歧化酶；
(D)MDA丙二醛；
（O:空白對照組；A1,A2,A3:低,中,高水平的FAS毒性處理；B1,B2,B3:低,中,高水平的RAS毒性處理；C1,C2,C3:低,中,高水平的FAS和RAS混合毒性處理）。
5.FAS和RAS對草魚腸道微生物的影響
作者對草魚腸的內容物進行16S rRNA測序，在FAS組中，主要腸道微生物是變形菌、厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門（圖7A）。在RAS組中，變形菌、厚壁菌門、擬桿菌門、梭桿菌門和放線菌門佔優勢（圖7B）。經FAS和RAS處理後，魚腸中微生物的多樣性和豐度發生顯著變化（圖7C）。根據OUT數據，FAS組(T0-T3)和RAS組(S0-S3)的微生物多樣性和優勢菌種丰度差異顯著(p<0.05)。T3與T4、S3和S4的微生物多樣性差異不顯著(p>0.05)。半透膜雖然未能改變微生物的多樣性，但顯著改變了魚腸中微生物的優勢菌種和相對丰度。這些結果表明魚受到了藻類分泌和分解產生的溶解成分或小顆粒的影響。
在本研究中，FAS和RAS的處理導致腸道微生物結構從以變形桿菌爲主轉變爲以厚壁菌門、擬桿菌門、梭桿菌門和放線菌門爲主。這些變化可導致腸道微生物的失衡，並可導致炎症、吸收功能障礙，甚至宿主死亡。
圖7 | FAS組和RAS組的草魚腸道微生物分佈，top50_OTU_系統發育樹&熱圖
(A) FAS組草魚腸道微生物羣落分佈；
(B) RAS組草魚腸道微生物羣落分佈；
(C) top50_OTU_系統發育樹&熱圖；
（F0對照組；T1,T2,T3非微孔濾膜組，分別對應FAS低,中,高濃度；T4爲高濃度FAS微孔濾膜組；S1,S2,S3爲非微孔濾膜組，分別對應RAS低,中,高濃度；S4爲高濃度RAS微孔濾膜組）。
研究結論
該研究在RAS中發現了生態毒性化合物，檢測到黃麴黴毒素B1、嘔吐毒素和玉米赤黴烯酮。發現多種有毒物質的有害作用導致魚類死亡。經藻類對魚類的急毒性研究，發現RAS的毒性大約是FAS的15倍，根據物質對水生生物的毒性等級劃分將FAS定爲低毒性，而RAS爲中毒性。有毒的藻類溶液導致所有受試魚類鰓內充血、腸道損傷和高感染率。在細胞水平，觀察到器官細胞的變形和內部結構的損傷。FAS和RAS處理激活了魚類抗氧化防禦系統，並引起腸道微生物結構的變化，使體內微生物平衡破壞，最終導致魚類死亡。本文爲藻類的毒性等相關研究及其對水生生物的危害作用提供了依據。
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參考文獻：
1.Anas, A.R., Nakajima, A., Naruse, C., Tone, M., Asukabe, H., Harada, K.I. 2015. Determination of FVIIa-sTF Inhibitors in Toxic Microcystis Cyanobacteria by LC-MS Technique. Marine Drugs, 14(7), 1-15.
2.Fadrosh, D.W., Ma, B., Gajer, P., Sengamalay, N., Ott, S., Brotman, R.M., Ravel, J. 2014. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome, 2(1), 1-6.
3.Huang, L., Zhang, Y., Zhou, H., Ni, Y. 2018. Comparison of Intestinal Microbial Diversity in Cold-Water Fishes in Xinjiang by 16S rRNA High-Throughput Sequencing. Food Science, 39(10), 138-144.
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