Cell | 高精度蛋白質組學方法，揭示黑色素瘤抵抗免疫治療機制

前言

特拉維夫大學Tamar Geiger（Tamar Geiger課題組一直致力於使用高精度質譜的方法鑑定腫瘤治療的潛在靶點）教授團隊和Sheba醫療中心的Gal Markel團隊合作在Cell發表的題爲“Proteomics of Melanoma Response to Immunotherapy Reveals Mitochondrial Dependence”的研究成果，通過蛋白質組學技術和功能驗證，發現了黑色素瘤細胞的代謝狀態通過抗原呈遞機制的內在變化和腫瘤微環境的外在變化影響了T細胞殺傷，揭示了黑色素瘤代謝狀態與免疫治療響應之間的關聯，這可能有助於將來改善免疫治療響應。

中文標題：黑色素瘤對免疫治療響應的蛋白質組學研究揭示線粒體依賴性

研究對象：黑色素瘤

發表期刊：Cell

影響因子：38.637

運用生物技術：蛋白質組學

研究背景

免疫療法徹底改變了轉移性黑色素瘤患者的治療方法，極大地提高了患者的生存率。迄今爲止，這種成功很大程度上歸因於黑色素瘤的高突變負荷。目前，免疫檢查點抑制劑（ICIs）被認爲是黑色素瘤免疫治療的主要手段，尤其是針對CTLA-4或PD1免疫檢查點的抗體，但約有50％患者對治療無反應。腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）的過繼細胞療法（ACT）是一種不同的免疫治療策略，在黑色素瘤治療中顯示出很高的療效。當前人們已投入大量精力來確定預測性反應指標和揭示耐藥機制，但主要是使用組織學、基因組學和轉錄組學方法，尚還缺少對黑色素瘤進行深入的蛋白質組學分析。

研究思路

研究結果

1.黑色素瘤對TIL和抗PD1響應的蛋白質組學分析

爲了鑑定與免疫治療響應相關的蛋白質網絡，作者收集了116個IV期黑色素瘤樣本，包括42例接受TIL治療的患者和74例接受抗PD1治療的患者，並進行了蛋白質組分析。

作者將每個隊列分爲響應組（包括部分響應者和完全響應者；n = 61）和無響應組（進行性疾病；n = 48）。PD1隊列包括其他疾病穩定的患者（n = 7）（圖1A）。對患者臨牀參數的檢查表明，響應者和無響應者在總體生存率上存在顯著差異（圖1B）。年齡和BRAF突變狀態在兩組之間均無顯著差異。此外，先前的靶向治療（n = 16）或抗CTLA-4（n = 29）治療均未顯示出與響應相關。

在TIL隊列中發現性別之間存在顯著相關性，並且在響應者中血漿LDH水平低於兩個隊列中的非響應者（p值<0.005；卡方檢驗）。對於蛋白質組學分析，作者解剖了>80％腫瘤細胞的黑色素瘤區域。爲了獲得準確的蛋白質組定量，作者設計了一種super-SILAC混合物，該混合物由5種SILAC標記的黑色素瘤細胞系組成，可作爲標準化的參考。然後將混合物以1：1的蛋白質比例摻入每個黑色素瘤樣品中，以用作定量參考。混合的蛋白裂解液經酶切和分餾後，用Q-Exactive Plus或HF質譜儀進行檢測（圖1C）。結果共定量到10,376種蛋白質，響應者和非響應者之間的覆蓋範圍沒有明顯差異（圖1D-1E）。進一步過濾保留至少70％的樣品中鑑定出的蛋白質，這些蛋白中包括800多種與信號轉導相關的蛋白以及數十種受體和轉錄因子相關的蛋白，表明它們足以覆蓋細胞內過程的分析。

圖1 | 黑色素瘤對免疫治療響應的蛋白質組學

2.免疫療法響應者和無響應者的功能分析

作者通過Student t檢驗在TIL治療和抗PD1治療人羣中分別鑑定了414和636個響應者和無響應者間的差異表達蛋白。通路Proteomaps基於KEGG註釋對兩組差異蛋白進行聚類，發現兩種治療方法的圖譜有驚人的相似之處（圖2A）。在這兩種治療方法下，響應組均以較高水平的代謝蛋白爲主，而非響應組則爲剪接體和RNA代謝相關蛋白爲主。除代謝類別外，兩種治療方法的響應組均具有更高比例的抗原呈遞以及信號傳導相關蛋白。與兩種療法之間的通路高度相似性相一致，二維註釋富集分析結果表明兩種療法富集類別有着高相關性（R = 0.76）。在這兩種治療中，響應組的線粒體代謝通路都顯著富集（圖2B）。鑑於兩種療法的響應組譜圖在功能上相似，作者使用所有116例樣本的數據集，進行了WGCNA分析。結果中得到了一組與患者無進展生存期，完全或部分響應以及血漿LDH水平呈正相關的模塊。與之前的結果一致，這些模塊富集到了抗原呈遞，IFNG信號以及線粒體代謝通路（圖2C）。總而言之，這些分析強調了線粒體代謝的差異通常與免疫治療反應相關。

圖2 | 免疫療法響應者和無響應者間的功能差異

3.鑑定免疫治療響應的蛋白質標誌物

爲了鑑定與響應有關的特徵蛋白，作者使用基於SVM的分類方法（基於ANOVA的特徵排序），在TIL治療隊列篩選出8個特徵蛋白，其中6個在響應組中上調，2個下調（圖3A）。在抗PD1治療隊列中篩選出15種特徵蛋白，所有特徵蛋白均在響應組上調（圖3B）。兩組特徵蛋白沒有重疊，TIL治療隊列包括與脂肪酸和酮體代謝有關的蛋白質，抗PD1治療特徵蛋白由多種抗原呈遞相關蛋白組成。統計分析表明抗PD1隊列的15種特徵蛋白質中，有12種具有統計學意義（圖3C）。總體而言，作者在抗PD1治療隊列中發現了95種顯著變化的蛋白質，其中83種在響應組中上調。由於TIL隊列較小，因此沒有顯著變化的蛋白質。爲了提高分析的統計能力，作者合併了兩個隊列，發現響應者和非響應者之間有160種顯著變化的蛋白質（圖3D）。

圖3 | 響應於免疫治療的特徵蛋白

構建響應蛋白的相互作用網絡得到兩個高度連接的蛋白簇。第一個蛋白簇富集了IFN，抗原加工和呈遞機制蛋白。第二個蛋白簇富集了參與脂質代謝和TCA循環的線粒體代謝酶（圖4A–4C）。因此，儘管蛋白不一定在兩種治療情況下都能預測反應，但線粒體-IFN網絡與兩種治療都相關。TIL隊列中六個上調的特徵蛋白在抗PD1隊列中也上調（圖4D）。類似地，抗PD1隊列的15種特徵蛋白中的10種在TIL隊列中也顯示出相似的趨勢。重要的是，TIL響應組中MHC相關蛋白和抗原呈遞機制蛋白均高於無響應組（圖4E）。接下來，作者分析了特徵蛋白與無進展生存期（PFS）的關係。Kaplan Meier分析顯示在TIL隊列中，ACAT1，SUPV3L1和HTATIP2的高表達與更長的PFS正相關（圖4F）。在抗PD1隊列中，大多數特徵蛋白與更長的PFS顯著相關。對每個特徵蛋白在另一個隊列中的分析表明，它們幾乎與存活率無關（圖4F）。

圖4 | 免疫治療響應的綜合分析

蛋白質組學結果將黑色素瘤的代謝狀態與抗原呈遞和IFN信號傳導相關聯。鑑於這些分析可能已平均了來自不同細胞羣體的信號，作者通過連續切片的免疫組化檢查了關鍵特徵蛋白在組織水平上的空間表達。免疫組化結果與蛋白質組學數據一致，這些蛋白在響應組和非響應組間的表達有着顯著差異，並且這些蛋白是在黑色素瘤細胞中特異性染色（圖5A和5B）。線粒體標誌物和電子傳輸鏈（ETC）組分SDHA的染色在響應組的線粒體中顯著增加（圖5C）。作者接着檢查了代謝蛋白表達與T細胞浸潤之間的關聯（圖5C和5D）。與這些患者中更高的療效相一致，作者發現CD8或CD3 T細胞染色與特徵蛋白ACOT1，ACAT1和HADHA之間具有高度相關性（圖5C）。總而言之，這些結果證明腫瘤線粒體代謝與細胞免疫原性之間存在明確的聯繫，這值得進行下游功能研究。

圖5 | 代謝蛋白和T細胞浸潤的組織水平驗證

4. 黑色素瘤細胞免疫原性代謝調控的功能驗證

除了代謝特徵和免疫響應之間的相關性之外，作者考慮線粒體代謝是否在增加腫瘤免疫原性方面具有功能性作用。爲了誘導增加培養細胞的線粒體呼吸，作者用丙酮酸脫氫酶激酶的抑制劑二氯乙酸（DCA）處理了四種黑色素瘤細胞系，這增加了進入線粒體的碳通量。經DCA處理的細胞蛋白質組學分析顯示，涉及抗原呈遞的多種蛋白質表達增加（圖6A）。在MHC I類蛋白中，大多數DCA處理後的黑色素瘤細胞系中HLA-A表達略有降低，而HLA-B和HLA-C顯著升高，並且主要的抗原呈遞因子TAP1，TAP2和B2M在不同的細胞系中顯示出不同的行爲。根據蛋白質組學結果，作者發現DCA處理可增加細胞表面HLA的表達，並增加mRNA表達水平（圖6B-6D）。這些結果表明代謝狀態不僅與治療的響應相關，而且在增加總體抗原呈遞方面具有調節作用。

爲了直接在特徵蛋白和抗原呈遞之間建立聯繫，作者使用了CRISPR-Cas9系統在WM266-4和Mel526黑色素瘤細胞系中敲除了兩個TIL特徵基因ACAT1和HADHA。此外，在同種細胞中敲除了脂肪酸氧化的主要調節劑CPT1A。蛋白質組學分析顯示，與敲除細胞相比，對照組中的抗原呈遞和IFN信號以及氧化磷酸化和電子傳遞鏈過程顯著富集（圖6E）。對基因擾動的下游影響的研究表明，在Mel526細胞中敲除ACAT1，HADHA或CPT1A後，MHC I類強度降低，HLA II類呈遞細胞百分比降低（圖6F，6G）。蛋白質組學分析進一步驗證了這些結果，並顯示了其他關鍵抗原呈遞機制蛋白在兩組間具有更高的比值（圖6H）。這些結果表明，即使是TIL特徵蛋白中的單個線粒體蛋白也可以影響抗原呈遞機制和MHC I類表達。

圖6 | 抗原呈遞的代謝控制

代謝對抗原呈遞的作用說明這些可能影響T細胞識別和腫瘤細胞殺傷。爲了檢驗這一假設，作者將敲除組或對照組黑色素瘤細胞與匹配的T細胞共培養，並通過LDH分泌監測細胞死亡。與抗原呈遞機制蛋白下調相一致，在ACAT1，HADHA和CPT1A敲除後，特異性T細胞的殺傷力明顯降低（圖7A）。爲了通過體內小鼠模型檢查這些效應，作者敲除了小鼠黑色素瘤細胞系YUMMER1.7中的Acat1，並監測其對免疫活性小鼠的腫瘤生長和免疫浸潤的影響。結果表明敲除Acat1後腫瘤生長顯著增加（圖7B）。

基於體外觀察結果，作者假設敲除Acat1減少了T細胞識別，從而促進了腫瘤的進展。實際上，敲除Acat1的腫瘤細胞在RNA和蛋白質水平上均顯示MHC I類和PD1配體（Pdl1）表達的顯著降低（圖7C–7F）。此外，與IFNG一起孵育24小時後，敲除細胞顯示出對MHC I類，Pdl1和B2m的誘導作用降低（圖7G）。免疫細胞譜分析顯示，與對照相比，敲除Acat1的腫瘤中細胞因子產生的T細胞（cytokine-producing T cells）水平較低（圖7H和7I），而浸潤CD4 +和CD8 + T細胞的總百分比沒有變化（圖7I-7L）。此外，敲除Acat1的腫瘤中單核細胞髓樣細胞（monocytic myeloid cells）的比例顯著低於對照（圖7M），而巨噬細胞的比例顯著上升（圖7N）。總的來說，這些結果說明了這些蛋白質作爲影響黑色素瘤和免疫細胞調節劑的重要性。

圖7 | CRISPR敲除對腫瘤免疫原性和T細胞活性的影響

研究結論

免疫療法徹底改變了癌症的治療方法，但是大多數患者沒有響應。本文通過蛋白質組學研究來自腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）治療或抗PD1免疫治療的晚期黑色素瘤患者的臨牀樣品。統計分析表明在兩種治療中，響應組的氧化磷酸化和脂質代謝均高於非響應組。爲了闡明代謝狀態對免疫響應的影響，作者在代謝擾動或CRISPR-Cas9敲除後檢查了黑色素瘤細胞。這些實驗結果表明脂質代謝是通過提高抗原呈遞而增加黑素瘤免疫原性，從而增加了對T細胞殺傷的敏感性。總的來說，蛋白質組學分析揭示了黑色素瘤代謝狀態與免疫治療響應之間的關聯，這可能有助於將來改善治療響應。

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本文作者通過對兩種免疫療法患者組織樣本的蛋白質組學分析，提出黑色素瘤細胞的代謝狀態通過抗原呈遞機制的內在變化和腫瘤微環境的外在變化來影響T細胞殺傷。這些結果爲複雜的免疫代謝網絡增加了新的認知，這可能具有重要的治療意義。蛋白質組學在腫瘤研究領域進展迅猛，已有多種腫瘤的研究成果發表於頂級學術期刊。本文也又一次證明了蛋白質組學在生命科研領域研究中的重要作用。

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