前言
歐易/鹿生物合作客戶中國植物基因研究中心課題組在Journal of Agricultural and Food Chemistry發表的題爲“Extensive Post-Transcriptional Regulation Revealed by Transcriptomic and Proteomic Integrative Analysis in Cassava under Drought ”的研究成果，通過轉錄組測序技術和iTRAQ標記定量蛋白質組學聯合研究，在木薯葉片和根中分別鑑定出1242/715個差異表達基因（DEGs）和237/307個差異表達蛋白（DEPs）。本研究作爲木薯轉錄組學和蛋白質組學分析的首次研究，爲乾旱脅迫下木薯的轉錄後調控提供了新的方向。
中文標題：乾旱條件下木薯的轉錄組和蛋白質組聯合分析揭示了廣泛的轉錄後調控機理
研究對象：木薯葉片、根
發表期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry
影響因子：4.192
合作單位：中國植物基因研究中心
運用歐易/鹿明生物技術：轉錄組測序、iTRAQ標記定量蛋白質組學（由鹿明生物提供技術支持）
研究背景
乾旱是世界範圍內嚴重影響植物生長和作物產量的非生物脅迫之一。植物對乾旱脅迫具有複雜的調節機制，乾旱引起多種生理生化變化。在乾旱脅迫下，發現了數以千計的基因和多個調控信號通路參與，其中激素相關基因是乾旱調控網絡的關鍵調控因子。除了脫落酸（ABA）、茉莉酸（JA）和油菜素內酯（BR）等與ABA互作的激素也參與了乾旱脅迫，除此之外，與ROS信號轉導、熱休克蛋白（HSPs）、次生代謝和轉錄因子相關的基因也參與了乾旱脅迫響應。
隨着全球範圍內有關乾旱響應的轉錄組和蛋白質組學研究的增多，越來越多的證據表明轉錄組與蛋白質組變化常常不一致，表明轉錄後調控在脅迫條件下的植物響應中起着關鍵作用，進一步的研究表明，參與乾旱脅迫的轉錄後調控基因與HSPs有關。
木薯具有耐旱性，但嚴重而持續的乾旱脅迫極大地抑制了木薯的生長髮育，最終降低了其產量。隨着高通量測序技術的發展和木薯參考基因組的獲得，RNA-seq轉錄組學和iTRAQ標記定量蛋白質組學已成爲研究基因和蛋白質表達變化的重要工具。
研究思路
研究結果
1.乾旱脅迫下木薯的生理響應
與對照（0h）相比，木薯幼苗葉片在PEG模擬乾旱脅迫下3h輕度萎蔫，而在24h嚴重萎蔫。生理研究表明，PEG處理後24h，葉片脯氨酸含量、丙二醛含量、可溶性蛋白質含量、可溶性糖含量和POD活性顯著增加；而在3h時變化不大。這也表明：在PEG處理的24h內，數千個基因在葉和根的轉錄水平上發生了顯著的變化。
2.乾旱條件下木薯葉和根的轉錄組分析
隨機選取FPKM>1作爲檢測樣本間表達基因的閾值。總共有24276個表達基因（包括分別來自葉和根的20531和22508個基因），相當於木薯基因組註釋基因的74%。爲了驗證轉錄組測序數據的表達結果，採用qRT-PCR方法檢測了15個與ROS清除、激素代謝、熱休克蛋白和轉錄因子有關的基因。這兩種實驗放大的結果之間的相關係數較高（R=0.71-0.98），說明RNA-seq檢測的基因表達譜是可靠的。
3.木薯葉和根中的DEGs
與對照相比，乾旱脅迫下的葉片和根系中分別鑑定出1242和715差異基因。大多數DEGs只存在於葉片或者根系中，而只有少數DEGs是廣泛存在的（圖1A），這表明乾旱條件下葉片和根系的不同功能途徑分別受到影響。
爲了揭示PEG處理對功能途徑的影響，將這些DEGs分爲上調和下調兩組，分別對各組進行功能分類富集實驗。葉片中有503個上調和739個下調DEGs。根中有178個上調和537個下調的DEGs。這些結果在轉錄水平上提供了乾旱脅迫對木薯功能途徑具有影響。
圖1 | 顯示DEG和DEP數量的維恩圖
棕色箭頭和藍色箭頭分別代表上調和下調的DEGs/DEPs。
（A）葉片和根系之間的DEGs重疊；
（B）葉片和根系之間的DEPs重疊；
（C）葉片中的DEGs和DEPs重疊；
（D）根中的DEGs和DEPs重疊。
4.乾旱條件下木薯葉片和根系的蛋白質組分析
通過iTRAQ蛋白質組學研究葉和根樣品共檢測到53650和87104個多肽，分別檢測到5900和9440個蛋白質。共有6152個非冗餘蛋白（佔基因組註釋蛋白的18.7%）被定性和定量。
5.木薯葉和根中的DEPs
在葉片中發現138個上調和99個下調的DEPs（圖1B）。根中有162個上調和145個下調的DEPs。與轉錄組分析的結果相似，在葉和根樣本中變化相同的差異蛋白極少（圖1B），說明乾旱脅迫對葉和根中的不同功能途徑起作用。這些結果在蛋白質組水平上提供了乾旱脅迫對木薯功能途徑影響解析。
6.mRNA與蛋白質譜的相關性
在轉錄組學和iTRAQ蛋白質組學數據之間進行相關分析。在6152個定量蛋白中，有5763個被檢測到（FPKM>5）。相關分析顯示，在葉片和根中，所有定量蛋白的表達水平與其對應的mRNAs之間的相關係數較低。然而，在葉片和根系中，DEPs與相應的mRNAs之間的相關性高出約2倍（圖2），表明蛋白質和mRNA在乾旱脅迫中的變化具有一定的生物學相關性。
在葉和根中分別鑑定出1242和715DEGs以及237和307DEPs。在這些DEGs和DEPs中，只有61和42個在乾旱脅迫下的mRNA和蛋白質水平上，分別在葉片和根系中被統一調控。其中57和31個蛋白的表達變化趨勢相同，說明這些蛋白的表達變化主要受轉錄變化的控制。但也有一些基因在mRNA和蛋白質水平上呈相反的變化趨勢，表明這些基因/蛋白質的轉錄後調節參與其中。因此，蛋白質組學和轉錄組學的聯合分析將爲木薯乾旱反應相關機理的研究提供更多的信息。
圖2 | 葉片（A）和根（B）中蛋白質和mRNAs表達的相關性
R1，所有定量蛋白及其對應的mRNAs的相關係數；
R2，DEPs及其對應的mRNAs的相關係數。
7.葉片蛋白質組和轉錄組的聯合分析
通過比較DEGs和DEPs，在mRNA和蛋白質水平上，葉片中有49個上調基因和8個下調基因的變化趨勢相同。葉片中，有454個上調和731個下調的DEGs，其相應的蛋白質沒有差異表達（圖2C）。與功能富集結果一致，乾旱極大地誘導了棉子糖代謝相關基因的表達、ABA代謝相關基因的表達、非生物脅迫基因的表達。這些基因大多與熱應激有關。
相反，乾旱嚴重抑制了卡爾文循環相關基因的表達，光信號傳導相關基因，澱粉生物合成基因AGPase、SS、SPS、SPP，海藻糖生物合成途徑的TPPs、TPS等有關的基因。葉片中，有89個上調和91個下調的DEPs，其相應的基因沒有表達差異（圖1C）。乾旱顯著誘導了參與光合作用的蛋白質、糖酵解過程中參與ROS信號傳導的蛋白、氧化還原相關蛋白的表達。
8.根中蛋白質組學和轉錄組學的聯合分析
在轉錄組和蛋白質組水平上，有25個上調基因和6個下調基因在根中的變化趨勢相同（圖2D）。這些上調基因在AA合成代謝、糖異生/乙醛酸循環和非生物脅迫中顯著富集。這些上調基因中有8個（32%）屬於HSPs。4個熱休克蛋白和2個ROS清除基因（APX2和GSTU19）在木薯葉片和根系中普遍上調，表明它們在木薯乾旱反應中的關鍵作用。共有4個AA代謝基因表達上調。此外，與乙醛酸循環（AAE7）、ABA刺激（GLP5）等相關的基因也上調。相反，這些下調的基因在纖維素合成（如CSLA09）和過氧化物酶代謝（如PRXR1）中顯著富集。
在轉錄組學水平上，有153個上調和531個下調的DEGs發生顯著變化。乾旱顯著抑制了JA信號轉導和JA生物合成基因的表達，這些基因翻譯了JA生物合成途徑上的所有酶。乾旱嚴重抑制了一些與BR生物合成相關的基因，ABA生物合成的一些基因，與激素相關的受體激酶信號基因，鈣信號傳導相關基因等。
有137個上調和139個下調的DEPs，其相應的基因沒有表達差異（圖1D）。在41個與非生物脅迫相關的DEPs中，39個被顯著誘導，其中大多數（92%）是HSPs，強烈提示HSPs在蛋白質水平上是對乾旱的響應。根據功能富集結果，對參與14-3-3蛋白（GRF1和GRF2）信號傳導和TCA/org轉化（NADP-ME3和IDHIII）的蛋白進行了誘導。相反，乾旱顯著抑制了硝酸鹽轉運（NRT2.4）和磷酸鹽轉運（PHT1;5和PHT1;7）相關蛋白的表達。乾旱還顯著抑制了與細胞分裂（FIS1B和clap）、細胞組織（OBE2）和細胞囊泡轉運（VTI1B和SYP32）相關的蛋白質。此外，一些對非生物脅迫有反應的蛋白質（如ANNAT3、TUB6、YLS5和PIP2）和ROS清除（CSD1）也受到抑制。最後，通過RNA-seq和iTRAQ綜合分析，乾旱脅迫顯著影響了這些途徑，如圖3所示。
圖3 | 通過RNA-seq和iTRAQ聯合分析
乾旱脅迫對葉片和根系的代表性途徑有顯著影響。
上下調節的DEGs/DEPs分別用紅色和藍色表示。
研究結論
此研究採用轉錄組測序和iTRAQ標記定量蛋白質組學技術，分別分析了乾旱處理與對照下的木薯葉片和根系的差異表達基因（DEGs）和差異表達蛋白（DEPs）。本研究拓展了對轉錄後調控參與木薯抗旱反應的認識，也爲木薯抗旱改良品種的選育提供了候選材料。
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木薯是一種重要的熱帶/亞熱帶糧食作物，其產量受到乾旱的嚴重製約。本研究採用轉錄組測序和iTRAQ蛋白質組學技術。在木薯葉片和根中分別鑑定出1242/715個差異表達基因（DEGs）和237/307個差異表達蛋白（DEPs）。DEGs和DEPs主要在mRNA和蛋白質水平上單獨調控，只有少數在乾旱條件下被普遍調控，說明它們主要參與轉錄後調控。隨後，分析了這些特異或共同調控的DEGs和DEPs的功能，並對熱休克蛋白、次生代謝生物合成和激素生物合成相關基因的轉錄後調控進行了分析。本研究作爲木薯轉錄組學和蛋白質組學分析的首次研究，爲乾旱脅迫下木薯的轉錄後調控提供了新的方向。
文末看點：
上海鹿明生物科技有限公司，一直專注於生命科學和生命技術領域，是國內早期開展以蛋白組和代謝組爲基礎的多層組學整合實驗與分析團隊。經過近數年的發展沉澱，公司建立起了iTRAQ/TMT、4D-DIA、4D-PRM、修飾蛋白組學等蛋白組學技術平臺，同時爲加強學術交流，鹿明生物的小鹿諮詢窗口歡迎何爲老師的諮詢~~
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參考文獻：
Ding, Z., Fu, L., Tie, W., et al. Extensive Post-Transcriptional Regulation Revealed by Transcriptomic and Proteomic Integrative Analysis in Cassava under Drought[J]. Journal of agricultural and food chemistry, 2019, 67:3521-3534.
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文章來源於鹿明生物