fast_qc是一款用於測序數據質量分析的java軟件，它的使用非常簡單，這篇文章只簡單記錄fast_qc的使用方法，以及如何讀懂fast_qc的圖形化報告。
fastqc [-o output dir] [--(no)extract] [-f fastq|bam|sam] [-c contaminant file] seqfile1...seqfileN
-o --outdir #fast_qc生成的報告文件的儲存路徑
--extract #fast_qc在運行時默認會將生成的所有文件打包到1個壓縮文件裏（使用該參數便不再打包）
-t --threads #選擇程序運行的線程數（每個線程佔用250M內存）
-f #強制指定輸入文件格式（可以是fastq or bam or sam）
-c --contaminants #污染物選項，輸入爲文件（文件格式"Name\tSequences"，fastqc計算時會評估污染的情況並統計分析）
-a --adapter #接頭選項，輸入爲文件（文件格式"Name\tSequences"，儲存adapter序列信息，如果沒有使用該選項，fastqc會默認使用通用引物序列評估adapter污染）
1. Basic statistics
有效信息：
- 總序列數量
- 被標記爲低質量序列的數目
- 測序長度
-
GC含量
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2. Per base sequence quality
這張圖可以清晰得展示測序數據的質量值分佈：
涉及fastq文件中“鹼基質量值Q”的理解（參考：https://www.jianshu.com/p/39115d21ee17）
圖中各項元素的統計學意義：
- 橫軸：測序序列的第1個-第150個鹼基（圖中只取到99）
- 縱軸：鹼基質量值Q（Q越大，質量越好）
- 每1個boxplot都是該位置所有序列的鹼基Q值的統計：
上面的bar是90%分位數；
箱子的上邊是75%分位數；
箱子中的橫線是50%分位數；
箱子的下邊是25%分位數；
下面的bar是10%分位數 - 藍色的細線是各個位置的平均值的連線
我們通常取用Q>20的鹼基用於後續分析，圖中可以看到90bp之後，鹼基質量值Q的10%分位數便始終低於20，因此可以把90bp之後的序列切除。
3. Per sequence quality scores
- 橫軸：平均測序質量值（Q）
- 縱軸：reads的數目
該圖絕大多數reads的平均測序質量Q值在35以上
4. per tile sequence quality
分析flowcell上不同的物理位置的測序質量分佈情況，觀察是否存在系統誤差（fastq文件的第一行通常記錄有tile編號）
- 橫軸：測序序列的第1個-第150個鹼基
- 縱軸：flowcell上tile的編號
- 藍色代表質量分數較好，綠色代表質量分數差
圖中可以看到，剛開始測序時每個tile的測序質量都很好，隨着讀長的增加，一些個別的tile（如1201）很早便出現測序質量降低的情況
5. Per base sequence content
- 橫軸：測序序列的第1個-第150個鹼基
- 縱軸：AGCT鹼基在每個位置上的百分含量
理論上講，A與T相等，C與G相等，但是測序剛剛開始時由於儀器不穩定，很可能出現圖中所示的情況。因此，即使測序質量很高，也需要切掉開始的部分序列信息。
6. Per sequence GC content
- 橫軸：平均GC含量百分比
- 縱軸：序列數量
- 藍色的線：是程序根據經驗分佈給出的理論值
- 紅色的線：測序數據的真實GC含量分佈
因爲不同物種的核酸中，GC含量不同，因此如果紅色的線出現雙峯，很有可能數據中混入其他物種的DNA序列
7.Sequence Length Distribution
- 橫軸：測序長度（單位爲bp）
- 縱軸：測序序列的數目
理論上講，測序儀讀出的reads長度應該是完全相等的，但是總有一些偏差。不過偏差通常都在1bp之內，不會影響後續分析。如果偏差較大，則說明儀器在此次run中存在問題。
8. Adapter content
- 橫軸：測序序列的第1個-第150個鹼基
- 縱軸：adapter鹼基的含量
這張圖中，最後30多bp鹼基中存在一定比例的adapter序列，通常是由於建庫過程中，部分插入片段過短造成的 （低於讀長150bp）。
這種情況，需要在後續分析的時候需要先使用cutadapt軟件進行去接頭
9.Sequence Duplication Levels
- 橫軸：重複次數
- 縱軸：百分比
- 藍色線：描述總測序序列的重複率
- 紅色線：描述重複序列的重複率
從圖中的藍線可以看出，60%的測序序列是uniq序列（只有一條），20%的測序序列存在2條相同的序列，10%左右的測序序列存在3條相同的序列；從紅線可以看出，80%的重複序列重複出現2次，15%的重複序列出現3次，3%的重複序列出現4次
實驗層面如何減少duplication?
- 提高原始DNA含量（減少多次PCR產生的PCR bias）
- 建庫時DNA片段長度儘可能均一
分析層面如何減少duplication?
- GATK/Picard: MarkDuplicates
- Samtools: rmdup
- Opengen: gencore