前言
2020年11月中國科學院上海生化細胞所吳家睿，曾嶸團隊及海軍醫科大學張衛團隊合作在Cancer Cell發表題爲“Integrated Omics of Metastatic Colorectal Cancer”的研究成果，通過蛋白質組學技術發現結直腸癌可分爲三種亞型，每種亞型具有不同的臨牀預後和分子特徵。進一步結合磷酸化蛋白質組學，可以成功的區分轉移病例。藥敏實驗發現激酶-底物網絡分析可有效預測藥物響應。本研究爲更好地瞭解轉移性結直腸癌提供了寶貴的資源，有助於臨牀個體化醫療。
中文標題：轉移性結直腸癌的多組學研究
研究對象：結直腸癌
發表期刊：Cancer Cell
影響因子：26.602
發表時間：2020年11月
運用生物技術：基因組學、蛋白質組學、磷酸化蛋白質組學、藥敏實驗
研究背景
結直腸癌（CRC）是全球第四大致命癌症，每年有近90萬人死亡。衰老、不良飲食和生活方式都會增加患CRC的風險。CRC表現出高度異質性，分子水平的不同亞型在預後上存在差異。在治療方面，儘管取得了越來越多的進展，但CRC的死亡率，尤其是轉移性CRC的死亡率仍然很高。目前，只有DNA錯配修復狀態、RAS突變和BRAF突變狀態影響臨牀決策。而多組學研究可能會實現精準醫療從而有助於治療並改善預後。先前TCGA和CPTAC結直腸癌隊列的研究具有多組學特徵並展現出了分子異質性。然而這些研究更多關注非亞洲人羣的非轉移狀態。本文作者介紹了中國人羣轉移性結直腸癌基因組學、蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學的整合多組學研究。
研究思路
研究結果
1.研究概述
本文應用多組學方法對146例中國結直腸癌患者（CCRC）進行分析，包括70例轉移性結直腸癌（mCRC）患者和76例早期非轉移性結直腸癌（non-mCRC）患者。從每位患者身上獲取原發腫瘤組織（T）、遠處正常組織（N）、癌旁組織（P）和匹配的外周血細胞（BC）。對於mCRC，還研究了43個可用的遠處肝轉移組織（LM）（樣本策略）。作者對330個樣本進行了全外顯子組測序（WES），並使用DIA（data-independent acquisition）技術產生480個樣本的蛋白質組和磷酸化蛋白質組數據，共得到8,450種蛋白的定量結果和47,786個磷酸化位點的定量結果。這些患者的平均隨訪時間爲1240天。
2.中國CRC患者基因突變情況
在146名CRC患者的原發性腫瘤中，與癌症相關頻率最高的突變是APC（突變頻率爲65％），TP53（64％）和KRAS（32％）（圖1A）。與TCGA CRC數據集相比，CCRC的mCRC患者比例更高（圖1B）。此外CCRC在三個隊列中的直腸癌病例所佔比例最高（圖1B）。作者發現與其他兩個隊列相比，CCRC中的APC突變頻率顯著降低。此外CCRC中BRAF和PTEN突變的頻率也顯著低於西方數據集（圖1C）。
爲了鑑定與轉移相關的基因，作者比較了來自CCRC隊列的非轉移CRC和mCRC基因組改變的頻率。與非轉移CRC相比，mCRC原發腫瘤的突變負荷低（圖1D）。在CRC突變頻繁最高基因中（圖1C），只有SMAD4在mCRC患者的原發性腫瘤中的突變率顯著更高；XIRP2在mCRC患者的原發腫瘤中也高度富集（圖1E）。與非mCRC患者相比，mCRC患者的原發性腫瘤表現出更多的多克隆結構（圖1F），表明mCRC在腫瘤中轉移的可能性。
圖1 | 中國CRC患者基因突變概況
3.基於蛋白質組數據的亞型分類
作者運用蛋白質組學對原發性腫瘤和正常組織之間的2,440種差異蛋白進行了一致性聚類，得到三個聚類cluster（CC）（圖2A）。CC1的特徵是增加的RNA加工和DNA錯配修復（MMR）。CC2中上調的蛋白質富含細胞外基質-受體整合通路和免疫相關通路。CC3富含上調的DNA複製和代謝通路。三種亞型的無病生存率不同（圖2B），多因素分析表明亞型是一個獨立的預後因素。此外在轉移性結直腸癌患者中，CC3亞型的mCRC患者也顯示出最差的無病生存率（圖2C）。
接着作者在這三種亞型中鑑定了差異突變基因或體細胞拷貝數變化（SCNA）（圖2D），發現突變顯著富集於CC3亞型和直腸癌中（圖2E）。然後作者檢查了295個差異SCNA基因和蛋白質丰度的相關性（圖2D）。與CC1和CC2相比，大多數SCNA基因在CC3中表現出更多的缺失，而其蛋白質丰度在CC3中更高。這些基因在氧化磷酸化，RNA剪接，嗜中性粒細胞脫粒以及與選擇性剪接相關的通路中顯著富集。CC2中的下調蛋白質富集在DNA MMR通路（圖2A），但與微衛星不穩定性（MSI）狀態（圖2A）沒有明顯關聯。與其他亞型相比，PCNA，RFC1，RFC3，RFC4和SSBP1 MMR通路蛋白在CC2中顯著下調（圖2F）。爲了進一步探索驅動MMR的機制，作者選取了32個樣本進行甲基化實驗，發現RFC3和SSBP1的甲基化水平與其編碼蛋白的表達呈顯著負相關（圖2F）。這些結果表明，CC2亞型具有與蛋白質模式相關的獨特且非規範的表觀遺傳特徵。
本文中的蛋白質組學數據亞型與CPTAC蛋白質組和CMS分類整體一致（圖2G）。其中CC1與包含CMS1和CMS3的CPTAC亞型A和E相匹配，並且預後較好；CC2與亞型C和CMS4相似（圖2G），由於帶有間充質特徵的ECM富集，其預後通常比CC1（圖2A和2B）差；CC3對應於CPTAC亞型B，但與CPTAC亞型B不同的是CC3中沒有MSI的富集，CC3的無病生存率最差（圖2B），說明了該亞型的複雜性。這些結果可能與CCRC隊列中的轉移患者比例過高有關（圖1B）。
圖2 | CCRC的蛋白質組學分型及每種亞型的臨牀意義
4.磷酸化蛋白質組學區分非轉移CRC和轉移性CRC
蛋白質組亞型中未觀察到mCRC或非mCRC患者的富集（圖2A）。而通過T和N的差異磷酸化位點進行一致性聚類在蛋白質組亞型的基礎上進一步做子亞型，得到六種磷酸化蛋白質組學亞型的分類（圖3A和3B），則可區分mCRC和非mCRC。SC1，SC3和SC5富含mCRC患者，而SC2，SC4和SC6是非轉移性CRC的特徵。
功能富集分析發現在SC1，SC3和SC5中高表達的磷酸化蛋白在focal adhesion和adherens junction通路中富集（圖3C）。相反，在SC2，SC4和SC6中上調的磷酸化位點在亞型之間顯示出更多的功能相似性，並富含ERBB2信號傳導，子宮內膜癌，抗原加工和呈遞以及FcγR介導的吞噬作用通路（圖3C）。基於PhosphoSitePlus數據庫的激酶與底物的關係，作者發現SC1，SC3和SC5中的激酶與磷酸化位點之間大多呈負相關，而SC2和SC4中的正相關則較多（圖3D）。SC6的特徵在於激酶和底物之間的負調控，這表明CC3中的非mCRC更像是預後較差的mCRC（圖3E）。
圖3 | CCRC的磷酸化蛋白質圖譜
5.轉移性腫瘤的蛋白基因組特徵
對於mCRC，無論MSI狀態如何，在原發竈和轉移竈中均觀察到突變譜之間的高度一致性（圖4A和4B）。儘管原發竈腫瘤傾向於具有更多獨特的突變，但驅動基因和先前研究的轉移關鍵基因的突變都沒有明顯差異（圖4C）。此外，突變頻率最高的SCNA在原發竈和轉移竈之間沒有差異（圖4D），而轉移性mCRC腫瘤與原發性腫瘤相比有更多的單克隆比例（圖4E）。這些結果表明轉移性腫瘤源自原發性腫瘤或相同的祖先克隆。
但是，轉移性腫瘤的蛋白質組與原發性腫瘤相比有明顯差異。轉移性腫瘤與正常組織相比有更多的上調蛋白質（圖4F），這些差異蛋白可明顯的區分轉移組織與原發組織（圖4G）。在轉移性腫瘤中上調的蛋白質與ECM受體相互作用、藥物代謝、黏着斑（focal adhesion）和緊密連接（tight junction）相關（圖4H），而在轉移性腫瘤中下調的蛋白質則富含代謝通路，脂肪酸降解，檸檬酸鹽循環和氧化磷酸化（圖4H）。
圖4 | mCRC的蛋白基因組特徵
6.mCRC患者多個組織中的磷酸化位點-蛋白質的共同變化
接着作者運用磷酸化蛋白質組學關注42例有四種組織類型（N，P，T和LM）的mCRC患者，屬於CC1，CC2和CC3亞型的患者有10、21和11個。作者計算了四種組織間磷酸位點丰度與蛋白質丰度的皮爾森相關係數，並使用ANOVA鑑定了954種在三個亞型間存在差異的磷酸化位點-蛋白質對。這954對磷酸化位點-蛋白質的相關性可以區分這三種蛋白質組學亞型（圖5A），並且954對磷酸化位點與蛋白質的關係可以分爲三個cluster：CC1neg，CC2neg和CC3neg。使用MCODE分析方法，作者發現了五個關鍵的共同變化的磷酸化位點-蛋白質MCODEs，包括112個結點和355個邊（圖5B）。其中TP53（圖5C）和LKB1通路（圖5E）的轉錄調控分別是CC1neg和CC3neg最主要特異性MCODE。相反，mRNA剪接複合體是CC2neg最主要的MCODE（圖5D）。四個激酶PRKCD，MAPK1，MTOR和PRKAA1的七個位點在CC3neg的MCODE 1細胞凋亡中（圖5A），PRKCD-S304或MTOR-S1166與它們相應的蛋白質之間的相關性在每個亞型中是不同的，並且它們在三個亞型之間都顯示出不同的蛋白質或磷酸化位點表達譜（圖5F）。這些結果表明患者多個組織之間的磷酸化位點-蛋白質關係顯示出與蛋白質亞型相關的獨特特徵。
圖5 | mCRC患者多個組織中的磷酸化位點-蛋白質的共同變化
7.磷酸化蛋白質組爲mCRC患者鑑定藥靶
作者使用底物富集分析發現不同的亞型富含不同的激酶，並且同一激酶在原發竈和轉移竈中表現出不同的活性（圖6A）。對於具有可定量蛋白質水平的激酶和臨牀上可應用的藥物，作者分析了mCRC的42個配對N-T或N-LM組織中相應的磷酸底物丰度（圖6B和6C），共發現251對激酶-磷酸底物。在mCRC患者的不同組織和蛋白質組學亞型中觀察到了磷酸底物和激酶的高度異質性（圖6B）。
接着作者基於激酶-磷酸底物之間的皮爾遜相關係數，爲每種蛋白質組亞型的原發性和轉移性腫瘤構建激酶-底物網絡（圖6C）。例如CC1轉移性腫瘤中觀察到CDK4及其底物之間存在正相關，而在CC1原發性腫瘤中未發現顯著相關（圖6C）。此外CC3網絡與CC1網絡的相似性大於與CC2網絡的相似性（圖6D）。亞組內原發性和轉移性腫瘤之間激酶-磷酸底物網絡的差異也大於亞型間原發性腫瘤的差異。
圖6 | 磷酸底物與相應激酶的富集
爲了進一步探索mCRC患者的藥物響應潛力，作者在31種miniPDX模型中構建了三種激酶抑制劑（阿法替尼，吉非替尼和雷戈非尼）的藥理學測試（圖7A）。通過腫瘤細胞生長抑制（TCGI，％）測量了每種腫瘤對每種藥物的藥物響應效果（圖7B），發現來自同一個體的原發竈和轉移竈腫瘤對相同藥物可能表現出不同的反應（圖7B）。在31種miniPDX腫瘤中與三種激酶抑制劑相對應的基因中很少發現突變，因此結果表明磷酸化蛋白質組數據在考察治療適用性方面可能比突變更靈敏。
最後作者基於激酶-磷酸底物網絡構建模型預測藥物響應（圖7C-E），結果證明了激酶-磷酸底物網絡在預測mCRC患者藥物敏感性方面具有強大的潛力。
圖7 | 激酶-底物網絡分析和miniPDX藥物測試
研究結論
本文作者整合了來自中國結直腸癌隊列中146例患者的480個臨牀樣本的基因組學，蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學。蛋白質組學將CRC分爲三種亞型，每種亞型具有不同的臨牀預後和分子特徵。對原發竈的蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學分析，可以成功地區分轉移病例。轉移組織在遺傳學上與原發竈表現出高度相似性，但在蛋白質組學水平上卻差異較大，並且激酶網絡分析顯示原發竈腫瘤與其肝轉移竈腫瘤之間存在顯著的異質性。使用31種原發性和轉移性腫瘤的體內異種移植藥物測試顯示出個性化反應，且可以通過激酶-底物網絡分析預測，而這與藥物靶標基因是否突變無關。本研究爲更好地瞭解mCRC提供了寶貴的資源，並具有臨牀應用潛力。
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本文基於對轉移性和原發性腫瘤之間蛋白質組和磷酸化蛋白質組的分析，發現結合蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學數據的網絡分析可以準確反映藥物響應。這些結果表明原發竈和轉移竈中蛋白質組和磷酸化蛋白質組的檢測，有助於制定個性化治療策略。
文末看點
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文章來源於鹿明生物