這篇筆記是wet實驗的筆記，記錄了一些有關融合標籤的知識點。因爲之前沒有做過相關實驗，在和實驗室同學討論的時候鬧了個笑話。。。於是必須把這部分知識補起來。學習材料來源於abcam網站，如果需要的同學可以登錄abcam網站註冊一下，然後就可以下載英文版材料了。網址：https://www.abcam.com/proteins/fusion-tags
（一）融合標籤的簡介
在許多情況下，你需要將你感興趣的蛋白標記出來：比如你想觀察某一個蛋白在細胞中的定位，或者對它進行結晶純化。雖然市面上有很多抗體，但有時有些抗體很難特異性的靶向你想要的蛋白。爲了解決這個困難，科學家們就研究除了一個分子工具：純化標籤。
純化標籤是一個已知蛋白，或者一個肽段，它可以融合進你感興趣的蛋白。因爲這些標籤是很好識別的，所以有很多抗體可以選擇，也非常容易進行檢測。添加標籤的方法主要是進行重組DNA，即將攜帶有你感興趣的蛋白的編碼DNA與標籤整合在一起，將質粒轉入細胞。當質粒被表達的時候，融合標籤就會連接到你的蛋白上。
融合標籤的選擇非常重要，另外linker序列的選擇也很重要，linker序列將你的蛋白連接到標籤上，確保蛋白能夠正確摺疊，並具有正常的功能。
爲什麼要使用融合標籤？
優點：
（1）分離蛋白，即使沒有針對這個蛋白的特異的抗體
（2）在純化之後，有必要的話需要切除融合標籤
（3）同一個蛋白上可以接多個標籤以用於多種用途
（4）避免在免疫沉澱過程中抗體干擾
（5）熒光標籤可以用來在活細胞中觀察蛋白
缺點：
（1）有些標籤會影響蛋白質的功能
（2）需要進行標籤位置的優化
這篇文章僅僅對各種標籤進行介紹，但並不能說哪一種標籤必須放置哪個位置上，完全取決於你的實驗需要。
在瞭解融合標籤前，你首先要問自己幾個問題：
（1）你要融合標籤的目的是什麼？比如：增加溶解性？還是要進行親和純化？
（2）標籤的大小會不會影響你的目的？
（3）你需不需要大量產生你的目的蛋白？大的標籤對結構研究更有優勢，小標籤對於生理的相互作用研究更有優勢。
（4）標籤的位置放在哪裏更好？
（5）你的實驗用途對變性試劑耐受嗎？
如果你不確定你的標籤放在蛋白的哪個位置更好，那就需要多試幾種方案，改變或增加一個蛋白酶位點，修飾linker序列，或者添加多個標籤以用於不同用途。
（二）解密tags: 表位標籤， 親和標籤，熒光標籤
目前有三種主要的融合標籤類型：
表位標籤：一般是短肽段序列，可用於免疫技術應用，比如WB，Co-IP。
親和標籤：一般比較長，可以用於蛋白純化，或增加蛋白的溶解性。
熒光標籤：可用於活細胞/死細胞中，一般是用於成像實驗，比如細胞中定位和共表達實驗。
C端還是N端？
具體到把融合標籤放在蛋白的哪一端，完全取決於你要研究的蛋白：該蛋白如何摺疊？哪一端是功能必須的？比如，如果C端是被摺疊到蛋白的內部的，你就不會檢測到融合標籤的信號；或者你的蛋白在翻譯後某一端會被切割，那麼你的tag就會被切掉。
如果你不知道你的蛋白是如何摺疊的，那麼第一次做的時候，最好C端和N端都試試。有報道稱與N末端標記的融合蛋白相比，C末端融合蛋白更能定位於預期的細胞區域。但是也並不完全如此。
（三）串聯親和純化和標籤切割
（1）串聯親和純化
不是所有的標籤都是一樣的：每一個標籤都有自己的用途和限制。比如你需要讓你的蛋白更加可溶，並且需要利用標籤進行純化。就可以使用串聯親和純化（tandem affinity purification, TAP）來完成。TAP最初是指將特定的一系列的結構域融合到蛋白質上：鈣調蛋白結合肽（CBP）和金黃色葡萄球菌的蛋白質A（ProtA），通過菸草刻蝕病毒（TEV）切割位點分開。然而，這個技術現在可以用來融合2-3個融合標籤到蛋白上，但是通常仍然要包含一個TAP原始成分。這些標籤可以融合到蛋白的一端，也可以融合到兩端裏。如果需要在使用後將標籤切除，通常建議將標籤串聯。
His標籤在TAP中被廣泛使用，因爲它非常小，對於純化實驗效率很高。它們通常與麥芽糖結合蛋白（MBP）一起使用，可增加溶解性。另一種經常使用的結合是GFP和His。
雖然TAP標籤有很多優點，但是這個標籤非常大，有可能破壞蛋白功能。另外，如果你使用含有CBP的標籤，還可能與鈣信號相互干擾。所以，儘可能少的在你的蛋白上添加標籤。
（2）從蛋白上切割標籤
有的小標籤對蛋白的功能影響不大，但是某些大標籤，可能會產生意想不到的影響。在這種情況下，通常在你檢測完標籤後，需要切掉你的標籤。這就需要利用特異位點蛋白酶或者內含肽類來完成。
位點特異蛋白酶理論上不會影響你的蛋白功能。但是通常要在切割之後移除蛋白酶。一個解決方法是將蛋白酶和一個標籤融合，通過親和層析移除。幾種蛋白酶識別位點的選擇取決於你的需要。一個需要注意的點是，融合標籤是在N端還是C端？從N端切割標籤，留下的殘餘殘基少，從C端切割標籤，會留下4-6個多於的殘基在你的蛋白上。下面列出了幾種常用的蛋白酶位點（英文版，有需要的同學請自行查看）：
（四）親和標籤
親和標籤之所以叫這個名字，是由於它們經常被用於親和純化。親和純化是從細胞裂解液裏純化蛋白的一項技術。見下圖：
（1）谷胱甘肽-s-轉移酶（GST）
GST是一個由211個氨基酸組成的蛋白，分子大小約26KD。天然的GST可保護細胞對抗有害成分和氧化應激。GST的主要特點是其對三肽、谷胱甘肽親和，可用來進行親和層析。當含有GST的溶液通過以谷胱甘肽固定化的柱子時，GST就結合到谷胱甘肽上，從溶液中被分離出來。結合後，可用10mM谷胱甘肽洗脫下來。
需要注意的事項：
（1）污染：熱激蛋白有時也會被GST洗脫下來。你可以通過SDS-PAGE膠看到這種污染。爲了除去熱激蛋白的污染，可以在純化前用5mM 的氯化鈣和5mM的ATP處理細胞裂解液。
（2）失去蛋白功能：由於GST是一個大標籤，通常在溶液中作爲二聚體存在。有可能會降低你的蛋白活性和功能。可以利用蛋白酶（比如thrombin, factor Xa或者PreScission）切割。
（2）His-Tag
PolyHis標籤由於其小體積、結合穩定，被廣泛應用於蛋白純化。雖然His標籤可以有2-10個組氨酸殘基，但最常用的是6×His Tag，或者hexatag。組氨酸與固定的過渡金屬離子形成配位鍵，該性質可用於蛋白質純化。 鈷和鋅柱可用於固定金屬親和色譜（IMAC），但通常使用鎳柱。 因爲His標籤是短肽序列，所以標籤的最佳位置根據蛋白質特異性來定，它們很少影響融合蛋白的性質。
需要注意的點：
（1）內源性的His: His殘基廣泛存在於哺乳動物和昆蟲裏，所以會有很高的背景信號。 背景結合可以通過利用5-10mM咪唑清洗來避免，但這會過早的洗脫掉你的蛋白。另外，在用His抗體檢測時也應該注意背景結合。
（2）不建議將帶有金屬中心的蛋白質融合到His-tag上，因爲金屬可能會被親和樹脂吸收。
（3）應避免使用還原劑，例如二硫蘇糖醇（DTT）或β-巰基乙醇，因爲它們會降低親和性樹脂。
（3）Biotin
Biotin,也叫做維生素H，是一個分子量244Da的小分子。通常被接在二抗上作爲可視化技術，用於ELISA和WB。Biotin可與strptavidin和avidin分子形成非常牢固的結合，這個特點可以用來進行親和純化。由於Biotin是小分子，所以也不會影響蛋白的功能。另一個有價值的標籤是Strep標籤。 由於它的長度爲8個氨基酸（WRHPQFGG），也不太會影響蛋白質功能，並且與生物素可逆地結合在同一pocket中。 這意味着可以使用strptavidin樹脂有效純化與Strep-tag融合的蛋白質，並在溫和的緩衝液條件下使用生物素洗脫。
需要注意的點：
（1）四聚體與單體親和性樹脂：可以使用avidin包被的柱純化生物素標記的蛋白，該柱可以四聚體或單體形式使用。 四聚體abidin色譜柱需要強力的變性劑，例如尿素或鹽酸胍，用於洗脫過程，而單體樹脂可以使用10mM生物素緩衝液進行較溫和的洗脫。
（2）哺乳動物系統至少包含四種生物素化的蛋白質，會被與感興趣的蛋白質共洗脫。 但是，很少會在大腸桿菌系統中遇到非特異性結合。
（五）表位標籤
表位是抗原的一部分，是被抗體識別的那一部分。所以表位標籤通常被用來進行以抗體爲基礎的分析實驗。表位標籤一般來說比親和標籤短，因此很少會影響蛋白質的功能。雖然它們也可以用來進行親和純化，但是基於免疫抗體的柱子造價昂貴，並且效率也不如親和標籤。然而，表位標籤在檢測方面有着非常大的優勢。它被廣泛的用於細胞培養和免疫共沉澱。
（1）c-myc
人類c-myc在增殖細胞中有較低的表達水平，並在人類腫瘤發生中起重要作用。c-myc標籤是從c-myc基因的C-端衍生而來的，可以有效的被抗體識別。因此被廣泛的應用於蛋白檢測，例如WB，免疫共沉澱，流式。
需要注意的點：
（1）融合進分泌信號中：雖然c-myc標籤可以被放在蛋白的N端或C端，但是不推薦把它融合進分泌信號通路里，它會影響分泌通路的定位。
（2）親和純化：雖然它也可用於蛋白純化，但是很少用它。是因爲洗脫要求在非常低的pH值條件下進行，會影響蛋白質功能。
（2）HA標籤
人類流感病毒血凝素（HA）標籤是從HA糖蛋白衍生而來的，HA糖蛋白存在於流感病毒表面，負責病毒的感染力。由於HA是一個小肽段標籤，基本不會影響蛋白功能，可用於蛋白檢測，比如ELISA，WB，免疫共沉澱。抗HA抗體也可以用於蛋白純化。
要注意的點：
親和純化：不推薦使用HA標籤標記凋亡細胞中的蛋白。HA標籤會被caspase 3和caspase 7切割，會導致免疫反應性的降低。
（3）DDDK
DDDK或者FLAG，是唯一具有專利的標籤（sigma），比其他的表位標籤更親水。必要的情況下，DDDK標籤包含的腸激酶切割序列可以從融合的蛋白上切割掉標籤。
需要注意的點：
親和純化：雖然抗DDDK抗體也可以有效的進行蛋白純化，但是通常比其他的柱子要更加昂貴。
（4）V5
V5標籤是由paramyxovirus simian病毒中P蛋白和V蛋白衍生而來的，V5標籤有兩種大小，9-14氨基酸。但是較長的是常用的。有時會將V5標籤與His-tag結合使用。
需要注意的：
交叉反應：如果你使用的是哺乳動物表達系統，可能會出現交叉反應。
（六）熒光標籤
自從1992年，GFP基因被克隆出來，目前有許多的熒光標籤可供使用。熒光標籤的一個最大的優勢就是non-toxic，因此可以被用於live cells。儘管熒光標籤很大，對絕大部分的蛋白質功能影響很小。
雖然GFP的大小是26.9KD，是經常被使用的一個熒光標籤，但是還有很多其它標籤可供使用。
激發，發射和亮度
如果你準備使用多種熒光標籤，一個非常重要的點是要選擇不同的激發光和發射光的峯，如果發射峯重疊，就非常難以區分兩種熒光。
通常，你希望使用可用光譜中最亮的熒光標籤進行蛋白標記，從而能夠獲得清晰的信號並克服任何潛在的背景熒光。 亮度值（brightness value）是蛋白質的消光係數和量子產率的乘積。 但是，所得數字可能難以解釋。 因此，一種常見的措施是將熒光標籤的亮度與一個標準的標籤做比較，例如和EGFP進行比較。
Maturation和bleaching
Maturation定義了熒光標記正確摺疊、形成髮色團和開始發射熒光的時間。在活細胞的time-sensitive事件中，一個短的maturation的時間至關重要。sfGFP爲例，可以在10分鐘內摺疊，而mOrange通常要4個小時。
Bleaching是光穩定性的度量。即髮色團在被激發後多長時間內失去發射光的能力。如果你打算進行一個長時間的延時實驗，那麼要考慮一個具有很高的光穩定性的標籤。T-sapphire的bleaching半衰期是25秒，而EGFP則穩定的多，一般爲174秒。
環境條件
與大多數蛋白質一樣，熒光標籤受ph值、溫度和氧氣水平的影響。根據你所使用的條件，可能需要挑選合適的標籤。
pH值可以影響激發和發射峯，並且大多數熒光標籤對酸敏感。有些甚至可以在pH值變化時改變熒光強度（例如pHTomato）。pKa值是pH敏感性的一個很好的指標。
此外，溫度和氧氣水平都會影響Maturation時間。低氧條件往往會延遲maturation時間。然而，新的熒光標籤，UnaG，即使在氧氣水平很低的條件下也能發出熒光。
密碼子優化
由於大多數熒光標籤來自水母或者珊瑚蛋白，而不是哺乳動物的細胞或組織，可能使用的氨基酸密碼子存在物種間差異，這可能導致表達水平低，信號弱。
幸運的是，許多較新版本的熒光標籤都已經進行了密碼子的優化，以便於在哺乳動物裏得到很高的表達。因此在使用前，需要確認一下你的序列是否可以在目標系統裏得到表達。
寡聚化
另一個非常重要的點是，要確定你的標籤是單體還是二聚體（單體通常用“m”表示，如mCherry）。這會影響你的實驗。很多早期的熒光標籤容易形成寡聚體，可能會影響你的融合蛋白的功能。例如EGFP，是一種單體標籤，但是在濃度很高的情況下，可以形成二聚體，它可以破壞亞細胞的細胞器或者破壞FRET這樣的實驗。