單分子實時測序
最近，我目睹了各種下一代測序（NGS）平臺的興起，這很有趣，因爲每個平臺使用不同的方法。以前，我曾寫過關於納米孔測序的令人興奮的可能性的信息-一種新的測序技術，該技術基於單鏈DNA穿過納米孔時產生的“簽名”電流。納米孔測序技術的優勢在於您可以獲得實時測序結果。
今天，我要談談另一個不同的NGS平臺，該平臺還允許實時排序，但是它使用了不同的原理。聽起來很酷吧？太平洋生物科學公司（PACBIO）支持這種單分子實時（SMRT）測序，我想與您分享有關這項技術的一些想法。
關於單分子實時測序的“ SMRT”是什麼？
這是一個很好的問題！好吧，它確實可以實時生成序列，就像納米孔測序一樣。但是，“ SMRT”技術的執行方式略有不同。
首先，這是一種“合成測序”類型的反應，其中包含與不同顏色共軛的核苷酸（A，C，T，G）。等待…現在聽起來像Sanger測序反應。然而，在Sanger測序中，雙脫氧核苷酸實際上終止了核苷酸鏈的延長。使用SMRT技術不會發生這種情況。
這項技術的妙處在於，每個SMRT流通池內部都有成千上萬個稱爲零模波導（ZMW）的細孔。每個ZMW代表一個反應室，位於反應室底部的（固定）DNA聚合酶裝置。孔徑（直徑約70nm，深度約100nm）太小，光線無法輕易通過，因此產生的照明觀察體積足夠小，只能觀察到一個核苷酸被摻入，並添加了每個鹼基。另外，在摻入核苷酸後，熒光標籤被切除。因此，每次將不同的核苷酸摻入親本模板中時，就可以檢測到不同的顏色。因此，SMRT技術和機器就像一臺巨型顯微鏡一樣工作，可以實時“看到” DNA合成！
唯一的不足是，需要使用SMRTBell技術將模板DNA預製成啞鈴結構的實體。該結構是封閉且圓形的，可確保長時間連續讀取。但是你不用擔心！您可以在PACBIO購買許多樣品和模板準備套件，以加快處理速度。
2 第二代NGS對 第3代NGS
因此，到目前爲止，您可能想知道PACBIO SMRT技術與Illumina NGS技術相比如何？儘管兩者都是“合成測序”平臺，但SMRT技術的一大優勢是實時採集信號，這意味着每次添加核苷酸之間都不會出現延遲。這意味着SMRT機器必須配備超靈敏的高速相機/傳感器來捕捉顏色變化，因爲DNA聚合酶能夠以大約1000bp / sec的速度穿過模板！在分子高速公路上談論快速的法拉利。這就是爲什麼PACBIO SMRT平臺被認爲是當前NGS平臺中更高級的第三代產品。
那麼還有什麼其他優點呢？
好吧，測序反應讀數的長度已大大延長。與使用Illumina平臺的200-300bp的典型讀碼相比，PACBIO的技術平均可達到20kb的長度，具體取決於核苷酸的化學性質和機器。這是一個很大的改進，因爲它可以讓科學家破譯包含多個重複序列的困難區域，並提供出色的基因組構建圖。
此外，另一個很酷的功能是SMRT系統可以根據光脈衝產生的動力學變化來區分某些常見的DNA修飾，例如甲基化。這真是太聰明瞭！
缺點
PACBIO SMRT系統看上去很棒，但並非沒有缺點。主要問題之一是與Illumina平臺相比，流通池的通量不那麼高。問題在於，並非所有ZMW都能成功完成測序反應。有些孔根本沒有DNA模板。因此，這是兩個巨人之間的爭鬥。PACBIO讀取長，但流通池成功率低，而Illumina讀取短，但通量更高。
另一個問題是，與Illumina平臺相比，使用PACBIO SMRT產生的測序錯誤率仍然很高。我相信，隨着時間的推移，這種情況會有所改善，但是現在您至少需要進行15次傳遞（經過15次）才能生成99％的準確數據。因此，這將在很大程度上影響時間和成本。
結論
那麼您如何使用這兩種技術？一種提供準確性，但讀取長度短，而另一種提供較長的讀取，但準確性較低。結合起來怎麼樣？沒錯，科學家們嘗試通過將兩個平臺結合使用混合測序方法，有時它可以帶來兩個世界的優勢。一方面，您可以使用PacBio平臺來快速，長期讀取基因組圖譜。然後，您可以使用Illumina測序來確認和挑逗遺傳細節！
我迫不及待地希望這種SMRT技術變得更加智能！
參考文獻
