本文主要介紹一種基於OpenCV的多平臺程序可以可靠且可重複地跟蹤齧齒動物或昆蟲等小動物的運動，並量化包括距離和速度在內的動作參數，以便檢測由於處理，環境富集或溫度變化而引起的活動變化。該系統提供了一種準確且可重現的實驗方法，具有潛力，可以在各種模型系統中對運動和行爲進行簡單，快速和靈活的分析。
介紹
大多數實驗性體內手術模型或動物會導致影響行爲和運動的生理效應。例如，誘發慢性疼痛或對光敏感可能在疾病的實驗模型中代表有用的結果，但是如果不借助自動動物跟蹤設備和複雜的分析系統，很難量化這些行爲。這種調查依賴於選擇適當的評估方法，並且通常受其限制。
現有方法在所收集的運動數據的質量，所選設備的設置簡便性和總體吞吐量水平之間折衷。紅外運動傳感器可以在很少的監督下長時間部署，相比之下，使用多個高分辨率CCD相機可提供高質量的運動記錄和分析，例如檢測到微妙的步態異常，但是這種方法無法進行高效率的分析。存在類似的策略來量化幼蟲期或成年期的昆蟲運動，範圍從手動計數交叉的網格到自動計數紅外束的交叉和自動視頻跟蹤。爲齧齒動物或昆蟲使用專用的攝影臺可以進行清晰的檢測，但可能會干擾正常行爲，同時會進一步增加進入障礙物，但是對於檢測行爲可能是必需的。可替代地，在家庭籠中拍攝自然運動目前需要專用的計算機和籠設置。專注於小動物行爲的成熟機構可能會在這種複雜的系統中進行投資，但是，沒有專門的基礎設施，研究人員幾乎無法利用這些方法輕鬆，靈活地測試運動或行爲的可再現變化。
如何在家庭環境中的運動捕捉，作者基於開源OpenCV的應用程序進行了分析。該系統使用低成本的設備，易於安裝，並且大多數動物研究人員已經可以使用。該應用程序的移動版本針對Android智能手機，安裝和使用非常簡單，不需要在獨立計算機上處理文件，而臺式機（PC / Mac / Linux）版本也可用於批量處理以下內容：來自任何數字記錄設備的視頻。我們發現，在使用家籠作爲階段時，小鼠具有很高的活性，這意味着該方法快速，可檢測到活動性的變化。
結果和討論
該研究項目演示瞭如何使用該程序對具有足夠背景對比度的動物或物體進行數字化拍攝和評估，如工作流程示例（圖 1）所示。
圖形概要，程序可以直接在兼容Android的智能手機或平板電腦上分析程序從各種可能來源捕獲的數字視頻以獲取小批量文件，或者將其傳輸到計算機以進行視頻修整和轉換以及高通量高分辨率分析。可在任何平臺上運行給出總運動摘要和.csv格式化跟蹤路徑。
實驗室和臨牀前研究中常用的三種不同的實驗模型系統（果蠅果蠅和幼蟲，具有增色對比的白色小鼠和單獨的黑色小鼠或在存在住房等刺激因素的情況下）用於開發和驗證用於評估現場行爲和活動參數的申請。
使用智能手機進行操作可以在錄製參數方面提供更大的靈活性，以及通過該應用程序在設備內進行直接處理的可用性。或者，可以使用該APP的傳輸和處理由網絡攝像頭或其他相機記錄的視頻文件。當然使用臺式機版本分析了更長的視頻和更大的數據集，以便利用提高的處理器速度和批處理能力。該APP量化總體運動總量，並創建一條詳細記錄所走路徑以及每幀動物大小和形狀的個人記錄。
功能的概述如圖2a所示：
（a）App功能流程圖，用於分析錄音。在App中打開視頻文件後，第一幀顯示爲預覽。可以繪製一個綠色的標記正方形以進行視頻裁剪（“裁剪”開關），或者替代性地引用諸如可見標尺之類的已知比例。（b）激活“閾值”開關可精確設置“色相，飽和度和值”（HSV）滑塊，以便設置用於動物檢測的顏色閾值。可以移動預覽框架下的滑塊，以在整個視頻中逐幀測試閾值設置。可以從“預設”選項卡中加載預設HSV閾值（請參見補充圖 1，a）。（c）綠色圓圈表示進行個體動物檢測。輕按“播放視頻”可在分析過程中運行視頻以檢查檢測準確性，而輕按“下一步”可繼續分析視頻。（d）描述App.csv輸出列的示例對象輪廓和標籤。（e）示例果蠅視頻和（f）路徑跟蹤，其中顏色指示相對瞬時速度。（g）在家用籠子或空的運輸箱中檢測到鼠標，尾巴底部的紅筆標記檢測到白色鼠標，並且有代表性的半透明紅色住房濃縮物。（h）在（f），並且處理後的路徑顏色表示瞬時速度。半透明的紅色正方形表示在圖3f的計算中使用的“框的中心”區域 。（i）用於在深色瓊脂平板上追蹤白色果蠅幼蟲的等效裝置。（j）幼蟲路徑圖，路徑顏色表示每幀對象（幼蟲）的長度。
通過使用視頻文件的第一幀，App允許用戶裁剪圖像並通過在圖像上拖動一個矩形來設置已知大小的比例。基於色相，飽和度和值（HSV）顏色空間的顏色閾值的優化和設置（圖 2b）
App可以在視場內找到所需對象以進行路徑跟蹤（圖 2c）。
預先安裝了通用閾值設置，而用戶定義的閾值則可以從“預設”菜單中加載（補充圖 1a），並導出以進行共享，以提高可重複性。
由於App需要HSV色差才能檢測背景上的物體，因此在照明，拍攝距離和視頻捕獲技術方面必須進行仔細的實驗設置。考慮到易用性，我們開發了軟件以接受多種視頻類型作爲輸入。在黑暗的環境中，或者對於快速移動的小動物，可以使用其他視頻源（例如紅外，夜視或高速數碼相機），並將視頻文件導入計算機或移動設備以在AnimApp中進行分析。但是，本文介紹的所有動物跟蹤都是在標準實驗室照明和內置移動電話攝像頭下成功進行的。
經過逐幀分析後，App生成跟蹤對象的圖，並使用滑塊允許逐幀檢查視頻中的路徑，並測量到所選幀的總距離。逗號分隔的變量文件（.csv文件），名爲App_summary.csv提供每個分析的日誌，其中包括視頻幀數，移動的距離和應用的縮放因子。
App還產生一個閾值設置的日誌文件和一個單獨的路徑文件包含有關每個幀上的對象的信息（對象質心，幀號和質心，最小旋轉矩形的寬度和長度，如圖2d所示 ）。此信息可以在其他分析軟件中進一步處理。提供了一個成年果蠅的視頻，作爲在果蠅 ARousal跟蹤系統8（圖 2e）中在標準透明玻璃管中進行簡單動物檢測和跟蹤的示例，併爲路徑顏色計算了瞬時物體速度（圖 2f）。運動距離分箱在應用程序中可用，並且可以通過在“預設”選項卡中選擇分箱大小進行調整，並顯示了該視頻的示例輸出。此示例果蠅視頻文件，閾值預設文件以及用於計算和顯示速度路徑的R腳本作爲補充文件提供。
爲了進行齧齒動物的拍攝，在從懸掛的智能手機分別錄製小鼠之前，打開家籠並去除濃縮物（圖 2g）。如前所述，在拍攝之前，使用紙板管間接處理小鼠以減少動物的焦慮感12。爲了進行初始優化，使用了黑色和白色小鼠。小鼠與白色被褥背景的強烈對比可以直接進行準確檢測，而NSG小鼠則需要在尾巴的尾部用永久性標記物進行顏色標記以增加對比度，然後再進行記錄。去除鬆散的被褥和富集物體後，只在單獨的籠子中對小鼠進行隔離拍攝，僅留下木地板。當使用家用籠子作爲記錄階段時，小鼠經常表現出挖掘和搜尋行爲，以及飼養到籠子的牆壁上，但是花費最少的時間進行梳理或靜止。當使用乾淨的空運輸箱作爲記錄臺（圖2h中分別顯示的跟蹤路徑）時，鼠標行爲發生了顯着變化 。果蠅幼蟲分別放在黑色背景上的含2％瓊脂的透明培養皿中（圖 2i，j）。我們還測試併成功跟蹤了其他昆蟲，例如瓢蟲以及動物特徵，這表明該App可用於跟蹤廣泛的目標。
優化了小鼠每次拍攝時間的長度，以平衡測量精度與時間效率。由於動物在整個錄製過程中移動不均勻，因此簡短的視頻容易出現較大的測量差異。通過拍攝每隻鼠標的6分鐘源視頻，並將其分成3、2、1和0.5分鐘的片段，我們分析了不同視頻持續時間引起的變化係數。與完整的6分鐘源（圖3a）相比，2分鐘切片產生的運動量化差異小於10％（圖 3a），但我們認爲運動較少的動物可能需要更長的視頻時長才能達到相似的準確度。
（a）相對於主6分鐘視頻，指示長度的視頻引起的C57B16鼠標移動的變異係數。（b）每分鐘主視頻片段的單個鼠標移動。（c）使用2分鐘的視頻，在家用籠子（“標準”）或乾淨的“空”運輸箱（例如，參見圖2g）中分析C57B16小鼠的運動 。（d）通過增加小鼠的活動來組織的，每隻對照的NOD / SCID-GAMMA小鼠的運動的每日變化，每兩週拍攝兩次，每次2分鐘。（É）總體C57BL6小鼠的運動和（˚F），首先使用控制標準的拍攝階段，然後引入半透明的紅房子，然後進行手動處理和刮擦，在籠子中心花費的時間百分比。統計數據：（c）韋爾奇的兩樣本不成對t檢驗；（df）單向方差分析與Tukey多重比較，ns：不顯着；* p <0.05；** p <0.01；*** p ＜0.001。
爲了確定對象小鼠的活動是否隨着動物習慣於相機的存在而發生變化，按時間順序對源視頻的1分鐘片段的運動量化進行了評估（圖 3b），並表明整個拍攝過程中的活動水平。但是，在錄製的後幾分鐘會看到更一致的結果，這表明如果延長適應錄製階段的時間，則較短持續時間的視頻可能同樣準確。
由於預期拍攝環境會改變齧齒動物的行爲，因此將使用“標準”籠子拍攝的小鼠的2分鐘視頻與在類似尺寸的完全乾淨的“空”運輸箱中拍攝的視頻進行了比較。在空的運輸箱中，鼠標的行爲發生了很大的變化，移動距離的顯着減少證明了這一點（圖 3c））。這表明，爲了量化最大運動能力，使用動物自己的家籠作爲記錄階段要優於空載階段。但是，側重於增加探索性行爲或自信心的干預措施的實驗設計可能會在使用乾淨的無菌記錄臺時有所幫助。這些發現表明，我們的分析系統能夠檢測環境變化引起的行爲的細微變化。
通過在6周的過程中重複記錄來分析單個小鼠的運動，以測試拍攝日之間單個動物運動的可再現性（圖 3d）。出人意料的是，籠伴侶之間的可重現差異是可檢測到的，表明每個人之間在基線運動傾向方面的細微差異。
爲了測試此方法的靈活性，我們使用了該App系統來測量行爲變化，以響應將富集對象引入家庭籠階段和直接進行動物處理（“劃傷”）的情況。野外試驗中已經描述了跟蹤齧齒動物與新物體的相互作用，而據報道直接處理動物對焦慮相關行爲有影響。在將紅色透明外殼引入家用籠子中心之前和之後的2分鐘內測量小鼠活動，然後移除外殼，將小鼠着腳10秒鐘，在此期間將動物保持倒立以模擬實驗方法，例如腹膜內注射。然後再繼續拍攝2分鐘（圖 3e）。值得注意的是，外殼的引入和操作引起的焦慮感都導致總的鼠標移動減少。爲了進一步表徵每種情況下的鼠標行爲，還需要通過詳細分析App路徑輸出來確定在記錄階段中心花費的總時間百分比（圖 3f），並顯示出動物對紅色住房的巨大吸引力。通過仔細分析輸出路徑文件，可以對行爲進行進一步分析，例如與特定位置的交互作用，籠中的局部環境，甚至是兩個不同動物之間的交互作用。這突出顯示了App如何用於量化動物整體活動，所走路徑和每隻動物的互動方面的行爲變化。與任何行爲研究一樣，這種量化方法無法區分這種變化的原因，因此需要仔細的實驗設計來解釋結果。
還使用設置在19°C或37°C恆溫箱內的1分鐘幼蟲視頻，對App應用程序進行了研究，以評估其在培養皿中的果蠅幼蟲的運動。歸一化到起始位置的疊加輸出運動路徑提供了一種易於可視化差異的方法（圖 4a）。幼蟲收縮，也稱爲步幅，以前已用作運動行爲的量度6。通過使用整個記錄中的幼蟲的長度和寬度，可以評估幼蟲的收縮（用綠色線表示，圖 4b），然後進行進一步處理以確定幼蟲收縮的平均幅度（圖4b虛線） ）。可以通過增加幼蟲長度與寬度的比率（圖4b中的黑線）來檢測幼蟲的轉向 。通過計數網格線交叉事件（圖4c）來手動量化幼蟲運動的標準方法與該App的自動運動量化（圖 4d）進行了比較。兩種方法都提供了相似的結果，與在37°C下相比，在19°C下孵育的幼蟲在1分鐘內的平均運動明顯降低（ 兩種方法的p <0.001）。AnimApp的使用速度比手動網格計數快得多，並且在檢測運動方面更爲精確，從而減少了數據點的變化。平均收縮幅度也被19°C孵育顯着抑制（p <0.001，圖。4e）。
（a）果蠅幼蟲在37°C（紅色）或19°C（藍色）下孵育的標準化路徑。（b）幼蟲長度（綠色），平均幼蟲伸展幅度（也稱爲“步幅”，虛線）以及幼蟲長度與寬度之比（次級y軸上的粗黑線）隨時間（幀）的示例軌跡）來自在37°C或19°C下孵育的幼蟲的代表性視頻。（c）通過計算網格線通過事件來對1分鐘內行進的距離進行手動量化，以及（d）使用App對同一視頻中的距離進行自動量化。（e）使用App輸出的每種情況的平均步幅或收縮長度。在Tukey箱形圖上繪製各個幼蟲的測量值。統計資料：Welch的兩樣本不成對t檢驗，* p <0.05；** p <0.01；*** p ＜0.001。
爲了探索單個視頻中多個顏色標籤的跟蹤，我們使用App分析了先前爲M-Track發佈的視頻，該應用旨在檢測小鼠10的修飾行爲。視頻顯示了一隻白色的老鼠，腳掌上標有紅色（右腳）或藍色（左腳）。通過在App上運行具有不同顏色閾值的視頻，可以成功檢測每個爪子和整個鼠標體。與M-Track公佈的結果相比，App產生的精確結果顯示每個爪的運動模式非常相似。
結論
該App評估方法的潛在適應症包括疾病或基因改造模型，作爲疼痛，對食物或其他化學物質的吸引或排斥的替代物的運動能力的量化，對光的敏感性或一般性焦慮。原始路徑輸出還可以量化來自源的吸引或排斥，並可以對移動路徑進行更詳細的映射，例如，如果與迷宮拍攝階段一起使用。但是，有害或富集的刺激都可以使動物的活動產生積極或消極的變化，因此任何結果的解釋都必須考慮到實驗設計以及與其他既定補充方法的比較。
論文地址或源碼下載地址：關注“圖像算法”wx公衆號 回覆"Anim"，該程序旨在減少研究人員的時間，改進實驗設計並完善臨牀前模型研究中評估行爲和活動結果的常用技術。將程序整合到常用的手持設備中，爲研究各種實驗模型系統提供了可靠，經濟高效且侵入性最小的方法，尤其是那些運動變化指示特定因果關係。