參考文獻：
Pertea M, Kim D,Pertea G M, et al. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experimentswith HISAT, StringTie and Ballgown.[J]. Nature Protocols, 2016, 11(9):1650.
1.clean reads質量檢驗：
用fastqc檢驗clean reads質量，代碼如下：
fastqc -o 【待測序列所在目錄】--extract -f fastq *.fq.gz（序列名稱）
質檢結果：
所有序列的Kmer Content均爲FAIL，Per Base Sequence Content、Per Tile sequence quality、sequence duplication levels至少有一個WARN。
Per Base Sequence Content圖中四條線交織，表明存在overrepresented sequence：
猜測：轉錄組中，表達量高的reads被識別爲overrepresented sequence，屬於正常現象。
參考：http://www.cnblogs.com/longjianggu/p/5078782.html
2.製作索引（indexes）：
在GENOSCOPE下載油菜基因組序列文件（.fa.gz）和基因組註釋文件（.gff3.gz）：http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/data/
hisat2-build /genome/GCF_000686985.1_Brassica_napus_assembly_v1.0_genomic.fna（基因組序列文件目錄） brassica_tran（索引名稱及輸出目錄）
3.序列比對（alignment）：
原始代碼：
hisat2 -p（線程數） 16 --dta -x indexes/brassica_tran（索引文件目錄） -1 /data/CleanData/$reads1（reads1目錄） -2 /data/CleanData/$reads2（reads2目錄） -S /hisat2_results/$【sample name】.sam（輸出文件名稱及目錄）
每個樣本都需通過上述代碼進行比對，封裝成BASH腳本運行：
vi alignment（新建空白文檔alignment，以下代碼在vi中輸入）
#! /bin/bash
# run some hisat2 alignments
while read line
do
reads1=${line}_1.fq.gz
reads2=${line}_2.fq.gz
hisat2 -p 16 --dta -x /indexes/brassica_tran -1/data/CleanData/$reads1 -2 /data/CleanData/$reads2 -S/hisat2_results/${line}.sam
done </files/samples.txt（將樣本名稱按行寫在位於/files目錄下的samples.txt文件中）
<Esc>:wq保存退出
chmod +x alignment（賦予可執行權限）
nohup ./alignment & 後臺運行腳本，輸出結果將儲存在生成的nohup.log文件中
4.samtools排序及格式轉換
原始代碼：
samtools sort -@ 16 -o /data/bamfiles/【sample name】.bam（bam文件名稱及輸出目錄） /data/hisat2_results/【sample name】.sam（sam文件名稱及輸出目錄）
封裝成BASH腳本：
#! /bin/bash
# samtools sort
while read line
do
samtools sort -@ 16 -o/data/bamfiles/${line}.bam /data/hisat2_results/${line}.sam
done < /files/samples.txt
5.序列初組裝（assembly）
原始代碼：
stringtie -p 16 -G /genes/brassica.gff（基因組註釋文件） -o /data/transcripts/【sample name】.gtf（輸出，比對結果，gtf文件） -l 【sample name】（命名規則） /data/bamfiles/【sample name】.bam（輸入，bam文件所在目錄）
封裝成BASH腳本：
#! /bin/bash
# stringtie 1st step
while read line
do
stringtie -p 16 -G/genes/brassica.gff -o /data/transcripts/${line}.gtf -l ${line}/data/bamfiles/${line}.bam
done < /files/samples.txt
6.Merge
stringtie --merge -p 16 -G /genes/brassica.gff -o stringtie_merged.gtf/data/transcripts/mergelist.txt
gffcompare檢測組裝結果：
gffcompare -r /genes/brassica.gff -G -o merged stringtie_merged.gtf
7.計算表達量並輸出成ballgown格式
原始代碼：
stringtie -e -B -p 16 -G /data/transcripts/stringtie_merged.gtf（用merge生成的gtf文件代替基因組註釋） -o /data/ballgown/$【sample name】/$【sample name】.gtf（輸出爲ballgown所需的輸入格式） /data/bamfiles/【sample name】.bam（輸入，bam文件）
封裝成BASH腳本：
#! /bin/bash
# stringtie 3rd step
while read line
do
stringtie -e -B -p 16 -G/data/transcripts/stringtie_merged.gtf -o /data/ballgown/${line}/${line}.gtf/data/bamfiles/${line}.bam
done < /files/samples.txt
8.ballgown分析差異表達基因（在R中進行）
>install.packages(‘devtools’)
>source('http://www.bioconductor.org/biocLite.R')
>biocLite(c(’ballgown’, 'genefilter’,'dplyr’,'devtools’))
>library(ballgown)
>library(genefilter)
>library(dplyr)
>library(devtools)
>file <- ballgown(dataDir='/data/ballgown',samplePattern=【sample名前綴】）輸入基因表達數據
>samplesNames(file)查看ballgown文件中各樣本的排列順序
>pData(file) <- read.csv(‘/data/geuvadis_phenodata.csv’）（導入自制的表型數據）
>filefilt <-subset(file,'rowVars(texpr(file))>1',genomesubset=TRUE)（過濾掉表達差異較小的基因）
>diff_genes <- stattest(filefilt,feature='gene',covariate=【自變量】,adjustvars=【無關變量】,meas='FPKM')（統計差異表達的基因）
將差異表達基因按pval從小到大排序，並寫入csv文件：
>diff_genes <- arrange(diff_genes,pval)
>write.csv(diff_genes,'/data/diff_genes',row.names=FALSE)