文章標題：Barcoded microbial system for high-resolution object provenance
發表期刊：Science
發表時間：2020.6
第一作者：Qian Jason；Zhi-xiang Lu；Christopher P. Mancuso；Han-Ying Jhuang；Rocío del Carmen Barajas-Ornelas；Sarah A. Boswell
第一單位：Harvard Medical School, USA
原文鏈接：
https://doi.org/10.1126/science.aba5584
編譯：李婷 雲南大學國際河流與生態安全研究院
摘要
確定物體源於何處是人類健康、商業和食品安全的一個重大挑戰。位置特異性微生物提供了一種經濟且靈敏的方法來確定物體的來源。本研究創建了一個合成的、可擴展的微生物孢子系統，該系統可在1小時內以米級分辨率和接近單孢子的靈敏度識別出物體的來源，且可以安全地引入環境，並從環境中回收。該系統解決了物體起源中的關鍵問題：環境持久性、可擴展性、快速簡便的解碼和生物保護。該系統與SHERLOCK（一種Cas13a RNA引導的核酸檢測方法）兼容，可實現廣泛應用。
引言
供應鏈的整體化使確定農產品和成品的來源更加複雜。在食源性疾病的防控方面，確定物體的來源可能十分重要，但目前的標籤技術過於費力且準確度較低。標記經過該地點的人或物的工具可作爲指紋識別和視頻監視的補充，有利於執法部門的工作。微生物羣落爲標記方法提供了一種潛在的替代方法。任何物體都可吸收環境中自然存在的微生物，因此可利用物體的微生物組成來確定其來源。但這種方法面臨的挑戰在於隨時間變化的微生物羣落多度，不同地點之間微生物組成的相似性，以及自然環境圖譜測試的廣泛性、昂貴性和耗時性。
爲克服這些挑戰，建議引進和使用合成的、不易存活的微生物孢子，這些孢子帶有條形碼，能夠唯一識別感興趣的位置（例如，食品生產區）。這些合成孢子可以提供一種靈敏、廉價和安全的方法來追蹤物體來源，但前提是要滿足幾個標：1）微生物必須與工業規模的生長模式相適應；2）合成孢子必須含生物成分，在野外不能存活，以免對生態造成不利影響；3）合成孢子必須在環境中存在並能標記通過它的物體；4）物體來源信息的編碼和解碼必須快速、敏感且特異。類似的條形碼方法也曾用於模擬病原體的傳播，但沒有明確解決這些問題。本文敘述了條形碼微生物孢子（BMS）系統，這是一個可擴展、安全和敏感的系統，可使用DNA-BMS混合物來確定物體的來源（圖1A）。
BMS技術的原理
BMS系統利用孢子在環境中長期存在而不會生長的自然能力。設計了非冗餘的DNA條形碼，將其整合到枯草芽孢桿菌和釀酒酵母孢子的基因組中，創建了一組BMS，可以組合使用以提供無限的識別碼。BMS可以使用標準克隆和培養技術大規模生產，通過噴灑接種到表面，並轉移到與接種表面接觸的物體上。爲了識別條形碼，從物體中取樣的BMS可以通過一系列方法進行分析和解碼，包括SHERLOCK、重組酶聚合酶擴增（RPA）法、基於Cas13a的核酸檢測分析、定量聚合酶鏈反應（qPCR）和測序（圖1A和圖S1A）。
圖1. 條形碼微生物孢子系統檢測的高特異性和靈敏性。
BMS的應用不會影響本地環境
首先，使用需要補充氨基酸才能生長的營養缺陷型菌株。第二，保證細胞萌發不足。對於枯草芽孢桿菌孢子，我們敲除了編碼萌發受體的基因和編碼細胞壁裂解酶的基因。從該突變菌株產生的1012孢子表明，它們無法形成菌落或在豐富的培養基中生長，並且在室溫下，可在 3個月內保持穩定且不發芽（圖S2，A和C）。對於釀酒酵母，在使用前加熱30 min，以殺死營養細胞和孢子。在豐富的培養基上培養超過108個煮沸的孢子不會產生菌落（圖S2、B和D到F）。用於產生BMS的抗生素耐藥盒通過位點特異性重組移除，以防止耐藥基因水平轉移到其它生物。最後，插入的條形碼不編碼任何基因，如果發生水平轉移，則不應賦予任何適合性優勢。追蹤土壤樣本的微生物組分，發現與隨時間的自然變化或對水分的響應相比，BMS接種對微生物組的影響並不顯著。
可同時應用多個BMS並進行解碼
我們設計了一系列串聯的DNA條形碼，可存在109個單個條形碼甚至更多，每一個的條形碼的Hamming距離都大於5。爲了測試條形碼設計的特異性，構建了22個條碼及其匹配的CRISPR-RNAs（crRNAs），並使用SHERLOCK體外檢測了所有的排列。22個crRNAs都清楚地區分了正確的條形碼目標（圖1B）。爲了擴大系統規模，我們設計了一種快速、簡便的方法來同時篩選大量的條形碼和crRNAs，以消除具有交叉反應或背景的條形碼和crRNAs。我們在體外驗證並執行了n-1條碼RPA反應，並用相應的crRNA和水RPA對照物測試了94對crRNA條碼，排除了17對背景值高的和7對交叉反應的crRNA條碼（圖S1、B和C）。爲了檢測體內的敏感性和特異性，我們將57個條形碼整合到枯草桿菌中，11個整合到釀酒酵母中。利用加熱和氫氧化鈉開發了一種有效的孢子裂解方案（圖S4），從而能夠利用SHERLOCK（圖1C）實現接近單孢子分辨率的檢測。crRNA條碼對的體內和體外特異性篩選結果相似（圖S1、C和D）。此外，條形碼採用了特定序列和共享組序列的串聯設計（圖S1A），以幫助在只有部分樣本包含感興趣的BMS的情況下進行高通量檢測。該組序列與野外可部署檢測兼容，可用於確定感興趣的BMS是否存在，然後再進行第二次分析以明確識別BMS（圖1D）。這兩步過程解決了現場可部署探測的吞吐量限制，並降低了測序成本。
BMS系統可在多種模擬真實環境中工作
在約1到2平方米的實驗中（圖S5A和表S6），使用qPCR從表面樣品或表面拭子中檢測和定量BMS。我們發現在沙子、土壤、地毯和木材表面上，BMS可存在3個月，且隨着時間的流逝沒有損失（圖2A）。值得注意的是，多次擾動測試（例如，模擬風、雨、吸塵或清掃）並沒有降低從地表檢測BMS的能力。其次，我們建造了一個約100平方米的室內沙坑（圖2B），在一定區域內接種BMS（圖2C），並且能夠在3個月內使用SHERLOCK檢測BMS（圖2D和圖6D）。擾動沒有引起對未接種區域的明顯傳播（圖2D）；即使是一個風扇掉入沙土的災難性擾動，也只能使BMS擴展數米（圖S6）。在室外環境中，接種在草地上的BMS在暴露於自然天氣5個月後仍然可以檢測到，並且在接種區域之外的擴散極小（圖2E）。這與其它芽孢桿菌報告的低水平再霧化一致。
圖2. 條形碼微生物孢子系統的持久性、擴散性和穩定性。
BMS可以靈敏地轉移至受試環境對象上
在1平方米規模的測試中，只需將BMS放在接種表面上幾秒鐘即可將BMS轉移到橡膠或木製物體上，從而產生高達約每毫升100孢子的反應輸入量。在100 m2範圍內，BMS可以轉移到接種沙坑內的鞋上（圖2F）。此外，在非接觸表面上行走數小時後，仍可以檢測到轉移到鞋子上的BMS，根據qPCR定量，當行走2小時時，BMS計數減少了兩倍（圖2G）。我們用經過BMS接種區域的鞋在未接種的表面上行走後，無法檢測到孢子。因此可得出結論，BMS可在環境中持續存在且不發生明顯的擴散，可以轉移到經過環境的物體上並保留，並且可以使用SHERLOCK敏感而特異的檢測到。BMS系統可用於標記特定的位置，以確定是否有人或物體經過該位置。我們將不同的表面劃分成網格；給每個網格區域接種一個、兩個或四個非冗餘BMS（圖3A）；並用不同的測試對象（例如鞋子）接觸它們。爲了模擬野外環境，我們使用便攜式光源、丙烯酸濾光片和移動電話攝像頭對SHERLOCK讀數進行成像（圖3A），並確定物體來源（圖3、B和C）。樣品採集後1小時內即可在野外確定種源。爲了評估系統對確定物體來源的敏感性和特異性，我們考慮了不同的分類標準，每個區域的BMS數量也不同。在接種4個BMS的區域中，假陽性率爲0.6%（1/154），假陰性率爲0%（0/62）。每個區域僅接種一個或兩個BMS就可確定物體來源，儘管錯誤率較高（圖3D）。可在四種測試表面類型（沙、土壤、地毯和木材）上確定來源。但在實際環境中需要進一步驗證以確定錯誤率。該實驗表明，BMS可在米尺度分辨率下確定物體來源，而這是利用自然微生物羣落特徵很難實現的。
圖3：使用條形碼微生物孢子系統和現場部署檢測來確定對象來源。
BMS系統可高效地追蹤食物來源
食源性疾病是一個全球性的健康問題，迫切需要確定食品污染源的快速方法。由於現代市場鏈的複雜化，目前的方法耗時較長，而且成本高昂。接種了枯草桿菌BMS的植物能夠將實驗室培育的葉狀植物映射回生長的特定盆栽中（圖4、A和B）。從第一組葉子出現後一週開始，接種BMS4次，匹配蘇雲金芽孢桿菌（Bt）孢子接種方案。最後一次接種BMS一週後，從每個盆栽中收集一片葉子和一個土壤樣本，用SHERLOCK進行測試。除兩株接受變異組條碼序列的植物外，其餘均爲陽性，表現出檢測的特異性（圖4B）。通過Sanger測序，確定了18個BMS植株生長的花盆。從DNA提取到序列識別所需時間不超過24小時。若通過大規模並行化的雜交檢測，可將這一時間縮短爲數小時。
BMS接種植物的交叉關聯並不影響種源的確定
爲了模擬食品加工過程中可能發生的交叉關聯，將接種了特定BMS的葉片混合。與接種的其他表面不同，與植物接種的BMS不容易轉移到與該植物接觸的物體上。儘管在葉片之間存在一定的轉移，但仍可通過Sanger測序確定每片葉子的起源。（圖4，C至E）
圖4. 條形碼微生物孢子系統確定產品來源。
Bt可以用來確定食物的來源
在農業生產中用Bt孢子作爲替代物來測試BMS是否能在現實的食物供應鏈中持續存在。對於已知Bt接種狀態的植株，我們正確識別了所有Bt陽性和陰性植株（共38株）。此外，在商店購買的24個產品中，有 10個產品檢測到了Bt。出乎意料的是，即使在清洗、煮沸、油炸和微波加熱之後，BMS和Bt孢子仍可以檢測到，突出了從熟食中確定來源的潛力。這些結果顯示了利用BMS系統確定產品來源的潛力。
結論
本工作展示瞭如何以高通量的方式製造合理的微生物芽孢，爲物源問題提供新的解決方案。本研究已證明：1）BMS在環境中持續存在；2）不會擴散到接種區外；3）從土壤、沙子、木材和地毯轉移到接觸物體上；4）允許使用實驗室和現場部署的方法靈敏和快速讀出。在現實環境中快速標記對象並確定其來源的能力有着廣泛的應用。數據表明：BMS可以在各種環境中工作，但需要進一步驗證。BMS系統的未來迭代可以設計爲有限的傳播，並控制在高流量地區使用。該系統還可以提供有關位置歷史記錄的時間解析信息，使其應用範圍更廣。
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