微生物來源的細菌素靶向宿主抗早期斷奶仔豬腹瀉研究
導讀
仔豬的早期斷奶可以縮短豬的屠宰週期並改善母豬的繁殖性能，然而早期斷奶容易導致應激性腹瀉，仔豬死亡率上升，生長性能降低。使用抗生素可以預防仔豬斷奶腹瀉，但由於病原菌抗生素抗性和抗生素殘留問題，尋找替代抗生素的益生菌來預防仔豬腹瀉是個新思路。華中農業大學農業晏向華教授課題組運用糞便微生物移植技術研究早期斷奶仔豬腸道微生物介導的腹瀉抗性機理，發現了兩種介導抗腹瀉的細菌Lactobacillus gasseri LA39和Lactobacillus frumenti可作爲潛在抗生素替代物，這對實施腸道菌羣干預改善早期斷奶仔豬腸道健康具有重要意義。
論文信息
原名：A Microbiota-Derived Bacteriocin Targets the Host to Confer Diarrhea Resistance in Early-Weaned Piglets
譯名：微生物來源的細菌素靶向宿主抗早期斷奶仔豬腹瀉研究
期刊：Cell Host & Microbe
IF：15.753
發表時間：2018年12月13日
通訊作者：晏向華
DOI: 10.1016/j.chom.2018.11.006.
背景
早期斷奶策略縮短了豬的屠宰週期，提高了母豬的繁殖性能，已普遍應用於生豬生產。然而，早期斷奶引起的應激會導致腹瀉，從而增加仔豬死亡率和降低生長性能。在過去的幾十年中，抗生素被有效地用於治療腹瀉或改善斷奶仔豬的生長性能。然而早期的抗生素治療不僅破壞了腸道菌羣的組成，影響了宿主腸道微生物羣落的代謝穩態，更嚴重的是抗藥性病原體和抗生素殘留在食品中的傳播。因此，在畜牧業中逐漸禁止使用抗生素。瑞典於1986年禁止在畜牧業中使用抗生素，歐盟自2006年起全面禁止在畜牧業中使用抗生素。然而，自1986年以來，瑞典早期斷奶仔豬的腹瀉發病率增加了50%，飼養成本增加了8%-15%。因此，尋找預防早期斷奶仔豬腹瀉的抗生素替代品對畜牧業和食品安全至關重要。2013年，該課題組研究發現將健康的從江香豬CM（Congjiang Miniature）糞便微生物移植到商品雜交仔豬LY（Landrace×Yorkshire）腸道內，可顯著降低仔豬早期斷奶腹瀉發生率。與此同時，仔豬糞便微生物區系發生顯著變化，即LY仔豬糞便微生物多樣性、物種組成、基因功能等向從CM仔豬的糞便微生物區系轉變。課題組就此展開研究，篩選與腹瀉抗性相關的關鍵候選微生物，以及對斷奶仔豬腸道微生物介導的腹瀉抗性分子機制的闡明。
實驗設計
對LY與CM仔豬進行實驗分組：
①LY：LY仔豬，不經任何處理，n=3;
②LY(saline): LY仔豬，day10-18隔日口服生理鹽水，n=3;
③LY（high dose): LY仔豬，day10-18隔日口服高濃度CM仔豬糞菌懸液，n=3;
④LY(low dose): LY仔豬，day10-18隔日口服低濃度CM仔豬糞菌懸液，n=3;
⑤LY(oxytetracycline): LY仔豬，day21日肌肉注射長效土黴素，n=3;
⑥CM ：CM仔豬，不經任何處理，n=3;
以上各組在仔豬斷奶後第3、5、6、8、11天收集糞便樣本
主要方法：16S V4、ITS基因擴增測序、構建突變菌株、QPCR、Western blotting、co-IP、細胞因子檢測
主要分析: 物種註釋、Venn圖、功能預測、pCoA分析、LEfSe分析、alpha多樣性等
結論
1.FMT導致LY仔豬腹瀉減少，腸道微生物羣組成改變
將耐受腹瀉的本地品種健康仔豬CM的糞菌移植進商品化引入的雜交品種LY，在早期斷奶之前通過口服給藥的方式，結果表明，將CM仔豬的糞菌（低劑量）轉移到LY仔豬，可顯著降低早期斷奶仔豬的腹瀉率和腹瀉指數。（腹瀉率和腹瀉指數是評定動物腹瀉情況的指標，腹瀉率越大、腹瀉指數越高，表示動物腹瀉越嚴重）（圖1A和1B）
對移植後LY品系仔豬小腸內菌羣進行16s rDNA和ITS基因擴增測序，分析了仔豬腸道微生物羣在早期斷奶後3、5、6、8、11天這5個時間點。數據表明，FMT導致腸道微生物α多樣性（尤其是細菌α多樣性）以及β多樣性（尤其是細菌β多樣性）從LY仔豬轉移向CM仔豬（圖1C-F）。同時腸道細菌羣落功能從LY仔豬向CM仔豬變化（圖1G）。綜上所述，LY品系移植後腸道內菌羣多樣性向CM品系轉變。
圖1. FMT可減輕腹瀉，並引起早期斷奶後1-11天
仔豬腸道微生物組成發生變化
2.功能菌株的篩選
爲了篩選對早期斷奶應激性腹瀉具有抵抗力的特定腸道微生物，通過對對照組與移植後LY系仔豬腸道菌羣進行對比，數據顯示，在早期斷奶後至少一個取樣時間點（3、5、6、8和11天），低劑量LY仔豬體內17種細菌的相對丰度顯著高於生理鹽水仔豬（圖2F）。其中5種細菌（L.frumenti、L.gasseri LA39、白痢丁酸桿菌、hallii真桿菌和hansenii藍尾菌）在早期斷奶後的所有取樣時間點，在LY（低劑量）仔豬中的相對丰度均顯著高於LY（生理鹽水）仔豬（圖2F）。然而在斷奶後的任何取樣時間點，LY（低劑量）仔豬中沒有真菌物種的相對丰度顯著高於LY（生理鹽水）仔豬（圖2G）。確定了這五種細菌與早期斷奶應激引起的腹瀉的抵抗力密切相關。
隨後研究人員將5種菌種分別進行移植，發現乳酸菌Lactobacillus.gasseriLA39或Lactobacillus.frumenti單獨移植即可促使仔豬產生腹瀉耐受。（圖2H和2I）。
圖2.對仔豬腹瀉抗性特定微生物的篩選與驗證
3.機制的研究
3.1 腸道微生物介導的腹瀉抗性依賴於分泌環狀gassericin A
作者接下來研究了L.gasseri LA39和L.frumenti介導的早期斷奶仔豬腹瀉抗性的機制。有研究人員發現L. gasseri LA39和L. frumenti 可分泌環狀gassericin A細菌素，作者假設L.gasseri LA39介導的腹瀉抵抗可能來自gassericin A對腸上皮細胞液體吸收和分泌的過程的影響。研究發現，LY（低劑量）仔豬和CM仔豬的糞便細菌gassericin A編碼基因（gaaA）丰度顯著高於LY（生理鹽水）仔豬和LY仔豬（圖3A）。五菌羣（Mix）組和L.gasseri LA39組的糞菌gaaA基因丰度均顯著高於對照組和PBS組（圖3B），說明分泌型gassericin A可能有助於早期斷奶仔豬的腹瀉抵抗。而將gaaA敲除後菌種再次移植無法引起對腹瀉的耐受（圖3C-F）。此外，將可表達gassericin A的重組大腸桿菌植入仔豬腸道也可引起腹瀉的耐受，以及無菌小鼠實驗的結果均表明，gassericin a對gasseri-LA39介導的無菌小鼠腹瀉抵抗至關重要。圖I、J數據表明，L.frumenti也編碼了gaaA基因和分泌的環狀肽gassericin A。
圖3. gasseri-LA39和L.frumenti介導的早期斷奶仔豬
腹瀉抗性依賴於gasserinA的分泌
3.2 胃泌素A與腸上皮細胞質膜結合，促進腸液吸收，減少腸液分泌。
與十二指腸和迴腸相比，空腸是早期仔豬腹瀉引起腸道炎症和組織形態學損害的主要部位。作者使用空腸上皮細胞來研究早期斷奶仔豬gassericin A介導的腹瀉抵抗的潛在機制。經體內和體外培養後免疫熒光發現gassericin A均可以結合於空腸上皮細胞質膜（圖4A圖4B）。使用gassericin A處理豬空腸細胞系IPEC-J2後可檢測到IPEC-J2細胞中參與與腸液吸收相關的蛋白質（NHE3、SLC5A1、DRA、PAT1）的表達上調，與腸液分泌相關的蛋白質（NKCC1、CFTR、CaCC1）的表達下調（圖4C和4D）。gassericin A處理後明顯降低了胞內cAMP、cGMP量，Ca2+水平沒有顯著變化。同時，研究人員利用體內數據也從蛋白水平驗證以及無菌小鼠實驗均表明gassericin A改變了上皮細胞參與液體吸收分泌的蛋白表。
圖4. gassericin A與仔豬腸上皮細胞質膜結合，增加腸液吸收，減少腸液分泌
3.3 Gassericin A通過KRT19受體激活雷帕黴素機制靶點介導的磷酸二酯酶活性而降低細胞環核苷酸水平，從而增加腸液吸收和減少腸液分泌。
通過KRT19將gassericin A與細胞質膜結合是促進gassericin A介導的腸液吸收和減少分泌的關鍵。爲了揭示gassericin A如何與腸上皮細胞質膜結合，我們用His標記的gassericin A和未標記的gassericin A作爲誘餌進行免疫沉澱分析，以尋找它們相互作用的蛋白質。研究發現IPEC-J2細胞中的KRT18或KRT19可能與gassericin A相互作用（圖5A）。免疫共沉澱（coIP）試驗證實，gassericin A與KRT19（一種位於細胞質膜和細胞質中的蛋白質）相互作用，而不是KRT18（圖5B）。進一步分析gassericin A與IPEC-J2細胞質膜中的KRT19相互作用（圖5C）。而敲除或者抗體封閉KRT19後，gassericin A處理無法下調胞質內cAMP和cGMP丰度、腸液吸收增強和腸液分泌減少。
圖5. gassericin A可結合於空腸上皮細胞膜表面KRT19蛋白
作者接下來研究了雷帕黴素介導的腸液吸收和分泌改變的機制腸上皮細胞質膜中gassericin A與KRT19的結合。Gassericin A介導的環核苷酸水平降低可能是由於環化酶分泌減少或磷酸二酯酶（PDEs）降解增加所致。研究人員觀察到gassericin A處理引起磷酸二酯酶活性增加，使cAMP和cGMP水解增加，而未影響環化酶活性。進一步證實該機制依賴於mTOR通路，數據顯示，mTOR磷酸化及其兩個下游蛋白的磷酸化顯著上調，這表明用gassericin A處理後mTOR活性顯著增強。而使用雷帕黴素抑制mTOR活性後則逆轉了gassericin A對cAMP和cGMP下調作用。總之，這些發現揭示了gassericin A與腸上皮細胞質膜中KRT19蛋白結合，然後通過激活mTOR介導的PDE活性降低細胞環核苷酸水平，從而增加腸液吸收和減少腸液分泌(見上圖）。
總結
哺乳動物腸道微生物數量衆多、功能強大，這些微生物有助於維護宿主的健康，越來越多的研究表明利用腸道微生物羣的靶向重組有對抗胃腸道疾病的潛力。在臨牀醫學上，糞菌移植是治療艱難梭菌感染（CDI）、炎症性腸病和腸易激綜合徵等胃腸道疾病的重要方法，然而糞菌移植的治病機制以及腸道微生物的作用機制仍待闡明。在該文發表之前，晏向華教授課題組就於Front Microbiol發文建立了標準的豬菌羣移植體系，包括健康供體豬的選擇，以及糞便的稀釋與儲存等詳細內容。就稀釋倍數（濃度、劑量）而言，本文使用低劑量糞便懸浮液的FMT的抗腹瀉作用更顯著，高劑量的的微生物移植有可能破環原有腸道穩態，這也提示我們，在使用FMT或益生菌進行腸道微生物靶向治療時，最佳的微生物劑量需要被考慮。
本研究不僅系統地研究了糞菌移植對早期斷奶仔豬腸道微生物組成（細菌與真菌）的影響，篩選出了gasseri-LA39和L.frumenti作爲早期仔豬腹瀉抗性相關的潛在微生物；而且更深入地在分子層面探索了具體機制：gasseri-LA39和L.frumenti分泌的gassericin A以宿主腸上皮細胞爲靶點，與腸上皮細胞質膜中KRT19蛋白結合，然後通過激活mTOR介導的PDE活性降低細胞環核苷酸水平，增加腸液吸收和減少腸液分泌，從而賦予早期斷奶仔豬腹瀉抵抗力。同時在無菌小鼠上也證明gassericin A可抗腹瀉，運用動物模型進行糞菌移植探究腸道菌羣與疾病或機體性狀間聯繫是研究的熱點，將無菌動物作爲糞菌移植受體是探究腸道菌羣與疾病性狀間聯繫的關鍵。越來越多的證據表明，腸道微生物功能在宿主物種之間保守，本研究的結果不僅提供了可預防仔豬腹瀉的替代抗生素的益生菌，也爲有腹瀉風險的哺乳動物提供了一種潛在的預防策略，可以說使用益生菌精確控制腸道微生物羣已成爲胃腸道疾病治療的一個有前途的策略。
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