劉小澤寫於2020.7.21
爲何取名叫“交響樂”？因爲單細胞分析就像一個大樂團，需要各個流程的協同配合
單細胞交響樂1-常用的數據結構SingleCellExperiment
單細胞交響樂2-scRNAseq從實驗到下游簡介
單細胞交響樂3-細胞質控
單細胞交響樂4-歸一化
單細胞交響樂5-挑選高變化基因
單細胞交響樂6-降維
單細胞交響樂7-聚類分羣
單細胞交響樂8-marker基因檢測
單細胞交響樂9-細胞類型註釋
單細胞交響樂9-細胞類型註釋
單細胞交響樂10-數據集整合後的批次矯正
單細胞交響樂11-多樣本間差異分析
單細胞交響樂12-檢測Doublet
單細胞交響樂13-細胞週期推斷
單細胞交響樂14-細胞軌跡推斷
單細胞交響樂15-scRNA與蛋白丰度信息結合
單細胞交響樂16-處理大型數據
單細胞交響樂17-不同單細胞R包的數據格式相互轉換
單細胞交響樂18-實戰一 Smart-seq2
單細胞交響樂19-實戰二 STRT-Seq
單細胞交響樂20-實戰三 10X 未過濾的PBMC數據
單細胞交響樂21-實戰三 批量處理並整合多個10X PBMC數據
單細胞交響樂22-實戰五 CEL-seq2
單細胞交響樂23-實戰六 CEL-seq
單細胞交響樂24-實戰七 SMARTer 胰腺細胞
單細胞交響樂25-實戰八 Smart-seq2 胰腺細胞
單細胞交響樂26-實戰九 胰腺細胞數據整合
單細胞交響樂27-實戰十 CEL-seq-小鼠造血幹細胞
單細胞交響樂28-實戰十一 Smart-seq2-小鼠造血幹細胞
1 前言
前面的種種都是作爲知識儲備，但是不實戰還是記不住前面的知識
這是第十二個實戰練習
數據來自Pijuan-Sala et al. (2019)，研究的是小鼠E8.5發育階段的嵌合胚胎
數據準備
# 自己下載
library(MouseGastrulationData)
sce.chimera <- WTChimeraData(samples=5:10)
# 或者加載之前分享的數據
load('sce.chimera.RData')
sce.chimera
## class: SingleCellExperiment
## dim: 29453 20935
## metadata(0):
## assays(1): counts
## rownames(29453): ENSMUSG00000051951 ENSMUSG00000089699 ...
## ENSMUSG00000095742 tomato-td
## rowData names(2): ENSEMBL SYMBOL
## colnames(20935): cell_9769 cell_9770 ... cell_30702 cell_30703
## colData names(11): cell barcode ... doub.density sizeFactor
## reducedDimNames(2): pca.corrected.E7.5 pca.corrected.E8.5
## altExpNames(0):
names(colData(sce.chimera))
# [1] "cell" "barcode"
# [3] "sample" "stage"
# [5] "tomato" "pool"
# [7] "stage.mapped" "celltype.mapped"
# [9] "closest.cell" "doub.density"
簡單看一下colData中的各個信息
其中包含了6個樣本的信息，總共20935個細胞
table(sce.chimera$sample)
#
# 5 6 7 8 9 10
# 2298 1026 2740 2904 4057 6401
整合行名
library(scater)
rownames(sce.chimera) <- uniquifyFeatureNames(
rowData(sce.chimera)$ENSEMBL, rowData(sce.chimera)$SYMBOL)
2 簡單質控
之前作者已經對數據進行了質控，並把細胞做了標誌，這裏只需要把標記“stripped”、“Doublet”的細胞去掉即可
drop <- sce.chimera$celltype.mapped %in% c("stripped", "Doublet")
table(drop)
# drop
# FALSE TRUE
# 19426 1509
sce.chimera <- sce.chimera[,!drop]
3 歸一化
看到原來數據中也計算了size factors，那麼這裏就不需要計算，直接應用
sce.chimera <- logNormCounts(sce.chimera)
4 找高變異基因
我們的數據有6個樣本，可以說異質性非常高了。把它們當做不同的批次信息，並儘可能多地從中保存基因
library(scran)
dec.chimera <- modelGeneVar(sce.chimera, block=sce.chimera$sample)
chosen.hvgs <- dec.chimera$bio > 0
table(chosen.hvgs)
# chosen.hvgs
# FALSE TRUE
# 14754 14699
5 數據整合並矯正批次效應
使用了一種“層次整合”的方法，就是先將同種表型樣本整合起來（比如3個處理和3個對照先內部整合），再將不同表型的樣本組合（將處理和對照整合）
correctExperiments的含義是：Apply a correction to multiple SingleCellExperiment objects,
library(batchelor)
set.seed(01001001)
# 下面的merge.order就設置了整合的順序
merged <- correctExperiments(sce.chimera,
batch=sce.chimera$sample,
subset.row=chosen.hvgs,
PARAM=FastMnnParam(
merge.order=list(
list(1,3,5), # WT (3 replicates)
list(2,4,6) # td-Tomato (3 replicates)
)
)
)
看下結果：lost.var 值越大表示丟失的真實生物異質性越多
metadata(merged)$merge.info$lost.var
## 5 6 7 8 9 10
## [1,] 0.000e+00 0.0204433 0.000e+00 0.0169567 0.000000 0.000000
## [2,] 0.000e+00 0.0007389 0.000e+00 0.0004409 0.000000 0.015474
## [3,] 3.090e-02 0.0000000 2.012e-02 0.0000000 0.000000 0.000000
## [4,] 9.024e-05 0.0000000 8.272e-05 0.0000000 0.018047 0.000000
## [5,] 4.321e-03 0.0072518 4.124e-03 0.0078280 0.003831 0.007786
Large proportions of lost variance (>10%) suggest that correction is removing genuine biological heterogeneity.
6 聚類
g <- buildSNNGraph(merged, use.dimred="corrected")
clusters <- igraph::cluster_louvain(g)
colLabels(merged) <- factor(clusters$membership)
看分羣與細胞類型之間關係
tab <- table(Cluster=colLabels(merged), Sample=merged$sample)
library(pheatmap)
pheatmap(log10(tab+10), color=viridis::viridis(100))
7 降維
merged <- runTSNE(merged, dimred="corrected")
merged <- runUMAP(merged, dimred="corrected")
gridExtra::grid.arrange(
plotTSNE(merged, colour_by="label", text_by="label", text_col="red"),
plotTSNE(merged, colour_by="batch"),
ncol=2
)
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