劉小澤寫於2020.8.12
第一次接觸這個操作，下午跟着官網學習了下
果然，還是看官網的幫助文檔最香~
1 註冊NCBI GEO賬號
先註冊NCBI賬號，在：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
然後註冊GEO賬號，在：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submitter/
GEO可上傳的數據類型種類主要集中在芯片和高通量數據，比如芯片數據的四大主流：Affymetrix、Agilent、Nimblegen、Illumina，高通量的RNA-Seq、ChIP-Seq、ATAC-Seq等。另外還有RT-PCR、SAGE數據可以上傳
2 提交高通量測序數據須知
重點需要提交三部分：
- 實驗總覽（metadata spreadsheet）：參考樣本 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/examples/seq_template.xlsx
-
處理過後的數據（processed data files）：需要注意
- 不可以提交中間過程的比對文件（如BAM、SAM、BED），但如果結果只有這樣的比對文件，可以寫信給他們詢問是否合格
- 一般來說，提交什麼類型的數據取決於實驗類型：
- 表達量相關的數據：例如 genes, transcripts, exons, miRNA等表達量，需要原始表達矩陣 或 標準化後的表達矩陣（例如 Cufflinks, Cuffdiff, DESeq, edgeR的結果文件）。可以每個樣本一個文件，也可以使用一整個表達矩陣，但需要包含全部基因和全部樣本的信息（不可以只用差異基因）
- ChIP-Seq數據：必須包含有關於peak丰度的文件（如WIG, bigWig, bedGraph）
- 所有處理過的文件描述都必須體現在metadata文件中
- 如果提交了WIG, bedGraph, GFF, GTF文件，格式需要參考： UCSC file format FAQ
-
原始數據（raw data files）： GEO的原始數據也是會提交給SRA
- 必須是包含reads、質量值的原始fastq格式，不符合要求的數據會直接從GEO系統中刪除
- 如果測序數據使用了barcode（例如10x Genomics, Drop-Seq, InDrops的數據），可以提交不經過拆分的multiplexed files；對於其他多路複用（Multiplexed）的數據來說，必須要先經過demultiplex操作，將樣本分開
- PE測序數據：一般每個run會產生兩個數據（特殊情況下，每個run中的序列和質量值文件是分開的，也就是產生了4個文件）
- MD5Sum：推薦使用MD5驗證數據，方法是：
- Unix:
md5sum <file> - OS X:
md5 <file> - Windows: 需要用某些應用程序（如
winmd5free）
- Unix:
- 關於數據壓縮：爲了加快傳輸，可以適當將數據壓縮，但不強求。可以使用gzip、bzip2（後綴是
.gz或.bz2） ，但不要壓縮二進制文件（如BAM、bigWig、bigBed），也不要上傳ZIP文件
3 GEO接受的數據與不可接受的數據
GEO可接受的
基因表達、基因調控、表觀以及其他功能基因組學研究，例如
- mRNA profiling, RNA-seq (example)
- small RNA profiling, miRNA-seq (example)
- ChIP-Seq (example)
- HiC-seq (example)
- methyl-seq, bisulfite-seq (example)
GEO不可接受的
需要權限訪問的人類數據：可以提交給dbGaP and controlled access SRA
轉錄本組裝：可以提交給 SRA 以及 Transcriptome Shotgun Assembly Database)
宏基因組測序：可以提交給SRA
重測序以及變異相關研究：可以提交給SRA 或 合適的 variation resource
全外顯子數據：可以提交給SRA
4 重頭戲-實驗總覽（metadata spreadsheet）
參考樣本： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/examples/seq_template.xlsx
總共包含7大塊
4.1 SERIES
與文章相關的內容
- 標題（title）
- 摘要（summary）
- 實驗設計（overall design）
- 參與者（contributor）：可以寫多個
- 附件（supplementary file）
4.2 SAMPLES
與樣本信息相關的內容
- 樣本編號（Sample name）
- 樣本名稱（title）
- 樣本來源（source name）
- 物種（organism）
- 樣本描述（characteristics: strain、tissue、age、genotype、cell line、treatment）
- 與該樣本相關的文件（molecule、processed data file 、raw file）
4.3 PROTOCOLS
樣本的實驗操作以及建庫流程，簡單描述即可
4.4 DATA PROCESSING PIPELINE
數據處理描述，比如基因組版本是什麼、怎麼比對、怎麼過濾、怎麼找peaks、怎麼定量
4.5 PROCESSED DATA FILES
數據處理後的文件名稱
- file name
- file type：除了raw count數據，其餘可以統一寫成abundance measurements
- file checksum
4.6 RAW FILES
- 原始數據名稱（file name）
- 文件類型（file type）：比如fastq
- md5校驗（file checksum）
- 測序儀器型號（instrument model）
- 單端or雙端（single or paired-end）
4.7 PAIRED-END EXPERIMENTS
如果使用了雙端測序數據，需要列出各自的名稱
- file name 1
- file name 2
5 準備工作結束後，可以開始上傳
上面的實驗總覽（metadata spreadsheet）、處理過後的數據（processed data files）、**原始數據（raw data files） ** 都準備好，就可以開始準備上傳了
學習如何使用FileZilla進行上傳
首先會看到自己的上傳目錄，一會將用到
然後設置FileZilla：
- host (ftp-private.ncbi.nlm.nih.gov)
- username (geoftp)
- password (rebUzyi1)
此時會發生報錯，忽略它
修改Remote site，然後回車連接：
最後就可以將本地數據上傳到GEO指定位置了
Tips：爲了避免FileZilla上傳過程出現中斷，可以設置斷點續傳
6 最後，提醒GEO數據上傳完成
並且會提示再覈實一遍信息，沒有問題的話5個工作日內就會進行審覈
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