今天介紹DNA或蛋白質序列的兩兩比對（pairwise comparisons），除了具體操作，還加入了一些理論知識。
通過比對可以確定兩序列是否同源，找到序列中的結構域，比較基因及其產物等，從而獲得序列中的功能、結構、進化等信息。這次內容和之前一個推送內容有重疊，前期推送裏簡單介紹了全局、局部比對以及打分矩陣的概念，可以一看——【現學現賣】序列比對之算法。
上一章介紹的是序列的BLAST操作——【陪你學·生信】七、在數據庫中檢索相似的序列，結果返回很多序列。這時，如果想要詳細對比列表中的序列與我們的查詢序列，就需要兩兩比對。
一、準備對比的序列+選擇適合的方法
1. 選擇序列
（1）通過NCBI-BLAST，我們可以找到很多與查詢序列比對結果比較好的序列，然後基於工具給出的identity，E-value值（DNA序列（至少100bp）identity>70%，E-value<10^-4；蛋白質序列（至少100aa）identity>25%，E-value<10^-4），選擇可以繼續進行兩兩比對的序列。因爲這個指標一定程度上可以說明這兩條序列是同源的，同源序列的結構和功能一般相似，這樣接下來的比對才更有意義。
（2）當然兩兩比對的序列也不總是通過NCBI-BLAST結果，從數據庫中進行選擇。比如，實驗過程中發現兩條功能相似的片段，可以進行序列比對；或者實驗中發現自己的序列有某些確定的功能，那麼可以查找這個功能的關鍵詞，下載相關功能的序列進行比對。
（3）還有可能只利用一條序列進行“兩兩”比對，這個操作可以發現序列中重複的區域，低複雜度的重複模體，迴文序列以及RNA中潛在的二級結構。
2. 選擇合適的方法
序列比對有不同的方法，適用於不同情況，主要分爲兩類，點陣法和動態規劃算法，其中動態規劃算法包括局部比對和全局比對，簡介見下表。
方法
適用情況
Dot plot
查找序列重複區域；查找長插入/刪除片段；提取部分序列進行多序列比對（看對角線方向，很直觀）
Local alignments
通過高質量的，殘基-殘基的比對，分析兩條序列的同源區域
Global alignments
在序列全長水平進行比對，鑑別長插入/刪除片段；檢查數據的質量；鑑別序列中的每個變異
二、點陣法（Dot Plot）
Dotplot 點陣法是非常簡單、直觀的一種兩條序列比對的方法，它能展示出兩條序列所有可能配對的區域，由研究者選擇最有意義或自己感興趣的區域進行後續研究。通過點陣法還可以對序列自身進行比對，尋找序列內部的正向或反向重複序列。
如果序列很短的話，點陣法是僅用紙筆就可以完成的兩兩比對。主要方法是將兩條序列一條放在X軸從左至右，另一個放在Y軸從上至下。當對應位置的字符匹配時用“點”標記，最終形成矩陣。
如果兩條序列完全相同，矩陣中會有一條長對角線；如果不完全相同，那麼矩陣中就會出現不連續的對角線，如上圖。
上圖的是一個簡單的例子，兩條序列很短，如果是兩條長序列比對，可想而知點陣圖可能會凌亂和複雜。這時候，用滑動窗口（幾個位置爲一組）代替單個位點，可以更加顯著的觀察到兩條序列的相似區域。
有Dotlet，Dnadot，Dotter，Dottup等專門做dot-plot的工具，可以設置的參數很多，比如窗口大小和相似度閾值這種的（窗口大小爲10，相似度閾值爲8，指的是每次比較時取10個連續的字符，如相同的字符超過8個，則標記）。我用的是geneious prime，一個很綜合又方便的生信軟件，進行兩兩比對結果裏會出一個簡單的，窗口大小爲1的dot-plot圖（付費軟件，但是功能很強大，而且是實驗室付費，嘿嘿，那就用好了）。
三、動態規劃算法（dynamic programming algorithm）
從數學角度講，我們可以把核苷酸/氨基酸殘基看作字符，不同的匹配結果用給定的打分矩陣給分，因爲序列長度有限，理論上比對方式有限，我們可以計算出所有的比對結果的得分，再找出得分最高的就是最優比對。這個思路叫做枚舉法。不過工作量巨大，下面我們看看動態規劃法。
動態規劃用於在一個複雜空間中尋找一條最優路徑。接着上面枚舉法的思路，我們知道最終比對分數是各個殘基比對分數之和，那麼最好的比對結果，就是之前最好的比對+當前位置最好的比對。即局部最優解的組合就是全局最優解。
1. 全局比對（Global Alignments）
Needleman-Wunsch算法迭代公式
適用於序列整體水平相似程度較高的2個序列，Needleman-Wunsch算法是經典的全局比對算法。回溯時是從一端到另一端，整體回溯。以兩條短序列AAG和AGC爲例，看看兩種比對的不同。舉例中使用的打分矩陣如下：
打分矩陣
以AAG和AGC爲例的全局比對
2. 局部比對（Local Alignments）
Smith-Waterman算法迭代公式
局部比對適用情況：兩序列親緣關係可能較遠，但在局部具有相似性（比如有相似功能域，但是親緣關係遠的蛋白質序列）；分析一條序列中的重複片段；內含子存在導致序列之間出現大片段差異。
Smith-Waterman算法是局部比對算法的基礎。與全局比對的區別是公式里加了0，即在迭代時給分數加了下限（沒有負值）。
所以回溯時也不一定是從一端到另一端，而是局部回溯。所產生的結果就是局部比對結果，與全局不同的是，除了最優比對結果外，還會產生次優比對結果。
以AAG和AGC爲例的局部比對
五、使用Lalign進行比對（以局部比對爲例，全局比對操作一樣的）
1. 網址
https://embnet.vital-it.ch/software/LALIGN_form.html
2. 操作
放大操作頁面解釋各部分：
（1）選擇比對類型，這裏我選了局部比對。
（2）如果是選擇局部比對纔會有返回比對結果個數的選項，我寫了10個，所以結果這裏會從最優到次優給我列出10個不同局部比對結果。
（3）E-value閾值默認10，即隨機產生10次這樣的結果。E的閾值越小，比對越嚴格。
（4）打分矩陣，可選的有DNA，RNA打分矩陣和蛋白質打分矩陣PAM，BLOSUM。一般選BLOSUM62，這裏默認50，也差不多。BLOSUM矩陣後數字越大，比對越嚴格，越適合相似程度高的兩條序列；而PAM趨勢正好相反。
（5）產生空位罰分，對應BLOSUM50的默認值爲-12。沒有最優的值，如果我們設定空位產生時罰更高的分，那麼局部比對結果將更加局部和分散，產生很多小的比對。
（6）延長空位罰分，對應BLOSUM50的默認值爲-2，絕對值一般爲產生空位罰分的十分之一左右。當我們比對兩條親緣關係較遠的序列時，設定“產生空位罰分”相對高，而“延長空位罰分”相對更低會產生好結果，這表示空位罰分更看重空位的產生而非空位長度。
（7）（8）（9）就是輸入序列啦，可以複製粘貼，也可以（8）選擇數據庫，然後在（9）中輸入序列在該數據庫中的序列號。
3. 結果
結果將返回10個不同的比對，會給出打分和E-value，看E-value更能說明比對質量，當然也要同時考慮比對的長度。
六、網上免費比對工具
1. 下面有一些比對工具鏈接：（括號裏面是比對類型）
（1）Blast2seqs（Local BLAST）
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=align2seq&PAGE_TYPE=BlastSearch
（2）Lalign（Global/Local）
https://embnet.vital-it.ch/software/LALIGN_form.html
（3）xenAliTwo（Local for DNA）
https://users.soe.ucsc.edu/~kent/xenoAli/xenAliTwo.html
（4）Pal2nal（Protein against DNA）
http://www.bork.embl.de/pal2nal/
2. 有時候比對結果可能需要進一步分析，下面是推薦：
（1）LalnView——比對結果可視化軟件
下載鏈接
http://doua.prabi.fr/software/lalnview
（2）PRSS（embnet）——評估比對的顯著性
https://embnet.vital-it.ch/software/PRSS_form.html
（3）PRSS（virginia）——評估比對的顯著性
https://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi?rm=shuffle
往期相關內容：
【陪你學·生信】五、當你有一段待分析的DNA序列（基礎操作介紹）
【陪你學·生信】六、當你有一段待分析的氨基酸序列（基礎操作介紹）