这篇文章简单记录一下qPCR的原理以及它在新型冠状病毒检测中的应用，分享给身边好奇核酸检测的朋友，参考视频链接：https://www.bilibili.com/video/BV1454y1Q7U2/?spm_id_from=333.788.videocard.0
1. 荧光定量PCR
关于荧光定量PCR基本概念（基线、荧光阈值、CT值、扩增曲线、熔解曲线），如果不了解的话可以参考这份链接：https://wenku.baidu.com/view/668d2e0b79563c1ec5da713d.html
1.1 荧光定量PCR与常规PCR
qPCR(quantitative PCR)：利用荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，并进行定量分析。
常规PCR：对PCR扩增的终产物进行定量和定性的分析，无法对扩增反应实时监测。
1.2 荧光定量PCR如何监测产物量变化
如何实现监控信号：
在PCR体系中添加某种可发光物质，使用信号检测器检测
1） DNA嵌合型分子
sybr green：非特异性结合到DNA双链，产生荧光信号--反应体系内双链DNA浓度越高，荧光信号越强
2） 荧光标记的寡核酸序列
TaqMan 探针：探针5'端存在荧光基团，3'端存在猝灭基团，探针完整存在时不会发出荧光。当PCR反应体系中，探针特异性结合到DNA模版链，在DNA复制过程中，由于DNA聚合酶具有核酸外切酶活性，可以将探针从模版上切割下来，使荧光基团与猝灭基团分离，从而产生荧光。反应体系内，TaqMan探针结合的目标序列越多，荧光信号越强。
| SYBR Green染料法 | Taqman 探针法 | |
|---|---|---|
| 结构 | 嵌合型核酸染料 | 5' R --- Q3' |
| 优势 | 成本低；有熔解曲线生成 | 特异性高；低丰度基因定量可信度高 |
| 劣势 | 特异性较 Taqman 低 | 成本高；引物二聚体的形成，无法直观判定 |
| 应用 | SNP分型、表达定量分析、基因突变检测、病原菌检测 | 病毒检测、病毒载量检测、基因分型、基因突变检测、SNP分型、表达量分析等 |
1.3 qPCR的扩增曲线
从“qPCR的扩增曲线”这张图就可以看到，随着循环数的增加，荧光信号强度逐渐增加
- 基线期：没有明显的荧光信号
- 指数扩增期
- 线性扩增期
- 平台期（酶活性降低，dNTP被消耗尽）
2. 新冠病毒检测（RT-PCR）
我的文字会很啰嗦，不如视频看着舒服，如果视频不理解可疑参考文字指引
https://www.bilibili.com/video/BV1454y1Q7U2/?spm_id_from=333.788.videocard.0
RT-PCR（reverse transcription polymerase chain reaction）逆转录-聚合酶链式反应
包括以下几个步骤：
采集样本 --> 提取RNA--> RT成cDNA --> PCR扩增 --> 结果分析
2.1 采集样本
上呼吸道：咽拭子、鼻拭子
下呼吸道：痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液
采集后低温封存，尽快检测
2.2 提取RNA
常用方法：Trizol法、离心柱法、磁珠法
这里只记录Trizol法
1）Trizol 裂解
病毒的遗传物质为RNA，常常和蛋白质包裹在一起形成拟核。
Trizol的主要成分是苯酚，加入苯酚能够裂解病毒的蛋白质成分，将RNA从病毒中游离出来。
2）氯仿抽提
氯仿使蛋白质变性沉淀，同时氯仿是有机溶剂，苯酚易溶于氯仿中，而RNA易溶于水却不溶于有机溶剂。
经过离心，RNA存在于上层水相中，从而将RNA与蛋白质分离并抽提到水相。移液管将上层水相吸取到另一个干净的离心管中。
3）异丙醇沉淀
异丙醇能够夺取RNA周围的水分，使RNA聚集而发生沉淀，因此，在离心管中加入异丙醇并离心，获得RNA沉淀。
4）乙醇洗涤
RNA不溶于乙醇，而残留的异丙醇和杂质可以溶于乙醇。因此乙醇洗涤后离心并弃去清夜，达到提纯RNA的目的。
5）晾干
6）DEPC水溶解
DEPC为焦碳酸二乙酯，能够破坏RNase的活性（RNA容易降解，因为降解RNA的酶RNase无处不在）
使用DEPC水溶解RNA，能够保持RNA的完整性
2.3 逆转录获得cDNA
反应体系需要加入 oligo(dT)作为逆转录引物（因为病毒RNA3'端存在polyA尾巴）、逆转录酶、dNTP
根据碱基互补配对原则，逆转录酶以RNA为模版沿着5'到3'端合成碱基互补的DNA链（即cDNA）
2.4 qPCR扩增
这里采用的是探针法qPCR（👆上面1.2中提到的方法），即以cDNA某一高度保守基因序列区为检测靶标，通过PCR扩增，使这段靶标数量呈指数级增加。扩增的同时，产生强度与靶标数量对应的荧光信号，通过检测荧光信号来确定样本中是否含有病毒核酸。
2.5 结果分析
设定荧光阈值：以第3到第15个循环的荧光信号强度的标准偏差的十倍设定为荧光信号的阈值
获得Ct值：荧光阈值线与扩增曲线产生交点，交点对应的横座标为Ct值（Ct值的含义代表荧光信号强度达到阈值时所经历的PCR循环数）
阴性情况：
不存在Ct值：
Ct值>40
阳性情况：
Ct值<37
可疑情况：
37<Ct值<40（建议重复实验）
