摘 要 本實驗首次探討了沙棘葉中多糖的提取分離，測定其多糖的百分含量。
首先用蒸餾水清洗幹葉，以洗掉塵土、浮渣，去掉粗梗，剪細。適量石油醚反覆脫脂，濾渣自然揮幹，再用常溫水浸泡一次，80℃熱水浸泡兩次，以提取水溶性物質，然後合併所有水提液，採用旋轉蒸發儀在適宜條件（t＝50℃，抽真空0.09Mpa）下濃縮溶液至適宜體積，sevage法反覆操作去蛋白，最後用95％的乙醇使溶液達到不同的濃度而沉澱出多糖，優選出沉澱沙棘多糖的最優醇濃度。0－5℃冰箱中放置48小時後，過濾時用無水乙醇，丙酮洗數次，真空抽乾。
粗產品重新溶解於適量水中，然後通過大孔樹脂進行純化，蒸餾水洗脫，洗脫液在PH值爲8時，用20％的H2O2，50℃以下保溫2h脫色，以保證產品的顏色，最後用95％的乙醇使溶液醇濃度達到80％以析出多糖，重複上面的析糖操作，最後保存產品於乾燥處。
用D（＋）—葡萄糖作標準，苯酚－硫酸法制備標準曲線，求出線性迴歸方程，從而得到粗多糖的含量，由此也可以算出沙棘葉中多糖的百分含量。
然後進行TLC法初步定性確定多糖成分，再進行核磁共振定性分析，即可檢驗其準確成分。
關鍵詞 沙棘；多糖；提取；脫蛋白；AB－8大孔樹脂
Abstract The experiment is the first to research the Hippohae rhamnoides L leaves’ polysaccharides .The popose of the experiment is taking the polysaccharides from the Hippohae rhamnoides L leaves. First wash the leaves through the water to clean the dirt away, then use petroleum ether to degrease the leaves many times, extract the water-soluble material through hot water of 80℃, utilizing the revolval-evaporation under the condition( t=50 ℃, vacuum 0.09 Mpa) to concentrate the aqua to the proper physical volume . Isolation and composition of polysaccharides from the aqua ,alcohol precipitate by hot water extraction and remove protein from polysaccharides by "sevag",in order to get optimum alcohol concentration from precipitating Hippohae rhamnoides L polysaccharides.
And also try polysaccharides purified by AB-8 Macfofeticulaf Resin to achieve good results.Finally sum up the optimum technology of extraction and purification polysaccharides from the leaves. then lying in the refrigerator(0-5℃)two days,fitrated by alcohol , acetone,more than three times .
Dissolve into the proper water again;through AB－8 Macfofeticulaf Resin,water cleanse; add the sodium hydroxide to make the water’s PH 8 ,use the hydrogen peroxide (20% ) ,below 50 ℃ preservation 2 hours to ensure the color of the products.;then alcohol precipitating again.
With the D(+)- the glucose as the standard to figure out the standard curve in the way of “phenol-sulfuric acid”,thus obtaining the containment of the cude polysaccharides.
This method will increase the production of polysaccharides,and the use of AB－8 Macfofeticulaf Resin will enhance the purity of the products and reduce the cost.
Key words Hippohae rhamnoides L ;Polysaccharides; Extraction; Removal from polysaccharides；AB－8 Macfofeticulaf Resin.
1前言
沙棘（Hippohae rhamnoides L.），胡頹子科植物，分佈於歐亞大陸的溫帶、寒溫帶及亞熱帶髙三區。我國的東北、華北、西北和西南等地區是沙棘屬植物的主要分佈區。由於沙棘屬植物具有極強的生態適應性並富含多種營養成分和生物活性物質，已引起各國工作者的廣泛重視。
沙棘是一種富含生物活性物質的天然植物，目前已發現的生化成分達190多種。我國是最早利用沙棘的國家，在成書公元八世紀的藏醫學典籍《四部醫典》中就詳細地記載了它的藥性。但是最早對沙棘進行系統科學研究的是前蘇聯學者，我國對沙棘的研究始於1985年，並將沙棘列爲國家科技攻關項目加以重點研究，如今已有專刊――《沙棘》（由國家水利部主辦）。在前蘇聯，科學家開發利用沙棘由食用轉向以生化研究爲基礎的醫用研究，並將沙棘果油和沙棘汁及其製品運用於宇航食品，作爲特殊的“日餐必需添加劑”[1]。而在沙棘的開發中，黃酮類化合物一直是國內外學者較爲關注的一類物質。Peter C.H.Hollman等人就黃酮類物質的分析及其重要作用寫了一篇綜述[2]。前蘇聯學者發現沙棘黃酮具有扼制動脈粥樣硬化，降低血液中膽固醇等作用。國內王家良王秉文等對沙棘的研究較多，其研究表明：沙棘黃酮能顯著增加心臟的收縮和舒張功能有明顯的抗心肌缺血作用及抗心律失常作用[3－4]。
沙棘有很好的生態作用。是我國“三北”防護林的主要樹種之一，對於保持和改善那些地區的水土保持和生態環境起了重要作用[5]。
沙棘葉又是優良的飼料或飼料添加劑，沙棘具有更高的蛋白質和脂肪含量以及更好的適口性[6]，毒理學實驗表明，沙棘葉和沙棘殘渣均具無毒物質。沙棘的嫩葉還可以炒製茶葉、提取SOD用於化妝品等廣泛用途。
綜上所述，沙棘葉中的有效成分豐富，開發沙棘葉大有可爲。目前對於沙棘果汁、果油的開發研究利用已經比較成熟，但是其綜合利用技術不夠成熟，沙棘葉的研究也不是很多，尤其是沙棘葉中多糖的研究，國內外對此有關的研究還沒有見於發表，其生理活性目前也尚未證實，但是從相關報道來看，植物多糖主要有以下生物活性[7-14]：
免疫調節、抗癌防癌及抗遺傳損傷、抗輻射及促進骨髓造血機能、降血糖、降血脂（枸杞多糖）及抗動脈粥樣硬化（如雲芝多糖）、抗氧化及抗衰老、保肝以及其他抗凝血、抗胃潰瘍、抗炎、抗微生物、鎮靜、抗驚厥、止喘降血壓作用。
而從沙棘葉的多種功用可以估計它的多糖也應具有多種活性，而且在提取黃酮的工藝中可以同時充分提取多糖，大大增加沙棘葉的綜合利用價值，創造高價值產品，可對當地人民找到一條可行的脫貧致富途徑。這樣又可調動當地農民的積極性，大力種植沙棘對加快黃土高原綜合治理，促進生態環境的改變，防止沙漠化等具有重大的社會生態價值。對綠化荒漠更是形成良性循環。因此，本文對沙棘葉中多糖的探索研究很有必要，具有開創性意義。
因此本實驗首次研究沙棘葉中多糖的提取分離，借鑑其他植物多糖成分的提取方法，再考慮沙棘葉的自身特點，改進傳統分離多糖的方法，採用AB－8大孔樹脂分離純化各種多糖，無污染，效率高，節省成本，優選出沙棘葉多糖提取分離的最優工藝。測定其中粗多糖的百分含量，然後進行TLC法初步定性確定多糖成分，再進行核磁共振定性分析[15-18]，即可檢驗其準確成分。根據其具體成分，便可以知道沙棘葉中多糖的理論藥理作用。
2．實驗部分
2.1 原料及儀器
2.1.1 原料
沙棘葉（內蒙）；大孔樹脂（AB-8）；石油醚（60－90℃）；工業酒精（95％）；濃硫酸(95.5%)；苯酚(AR)；無水乙醇（AR）；丙酮（AR）；乙醚(AR)；D(+)-葡萄糖(AR)；PH試紙；
2.1.2儀器
752紫外可見光分光光度計；RE-52A旋轉蒸發儀；醫用離心機(4000r/min)；新飛電冰箱；SH2-D（Ⅲ）循環水式真空泵；
2.2 實驗方法
2.2.1 原料準備：
（1）試劑的準備
20％的H2O2：166.7ml30％的H2O2稀釋定容到250ml；
0.05M的NaOH溶液：2gNaOH於1000ml容量瓶中定容；
苯酚（5％）[19]：30g苯酚加水70ml使之溶解得到30％的苯酚，置於冰箱中避光保存。臨用時振盪混勻取4ml稀釋至20ml，即爲5％濃度；
樹脂的預處理及再生[20]：AB8樹脂用丙酮浸泡數天，溼法裝柱，再用丙酮洗至流出液與水混合不產生渾濁，再用大量水洗，水浸泡備用。
0.05M的NaOH溶液洗至無色，水洗至中性，95％的乙醇洗至無色，水洗。
（2）沙棘葉的預處理
將幹沙棘葉用蒸餾水洗去塵土，時間要迅速， 50℃烘箱中烘乾。篩掉較大的梗和粗枝，將葉子輕輕於研鉢中壓碎，不要太碎，放於乾燥處備用。
2.2.2沙棘葉粗多糖的提取
（1）脫脂
將100g預處理過的沙棘葉浸泡於1200ml石油醚中8小時，再換一次石油醚，以石油醚浸過葉子爲準。6小時後倒出石油醚，自然揮幹石油醚。
（2）提取
取脫脂過的葉子40g，分兩份，依次用蒸餾水250ml（常溫）、200ml（80℃）、150ml（80℃）均浸泡1小時。合併所有浸提液，共1200ml，旋轉蒸發濃縮至400ml（t＝50℃，抽真空0.09Mpa）。
（3）脫蛋白
脫蛋白有多種方法：三氯乙酸法，sevage法，等等，基於試驗條件，採用sevage法[21]較爲適宜。1/5濃縮液體積的氯仿，1/25濃縮液體積的正丁醇，劇烈振盪20分鐘，然後攪拌5小時，分液漏斗靜止分層1小時，分離掉有機溶劑和沉澱，再反覆一次，基本可除盡蛋白質。
（4）醇析
除蛋白後的溶液濃縮至50ml，加入95％的乙醇使其濃度分別達到50％、60％、70％、80％、85％。放在0－5℃冰箱中48小時。取出後抽濾，分別用無水乙醇，丙酮洗數次，真空抽乾,得到粗產品。
2.2.3多糖的純化
（1）過柱
將得到的粗產品重新完全溶解於適量水中，將預處理過的AB－8樹脂溼法裝柱，控制流速3ml/min，用水洗脫，控制流速6ml/min，洗至洗脫液遞加95％的乙醇無沉澱。
（2）脫色
濃縮液體至50ml，加入40ml0.05M的NaOH溶液，調劑PH值至8，再滴加20％的H2O2，50℃以下保溫2h除盡未反應完的H2O2。
（3）重析
將脫完色的溶液濃縮至50ml，加入95％的乙醇使其濃度達到80％，使其沉澱完全，放在0－5℃冰箱中48小時，取出後抽濾，分別用無水乙醇，丙酮，乙醚洗三次，真空抽乾。得到較純產品。乾燥處保存。
2.2.4總多糖含量的測定
標準曲線的製備[22]及樣品含量的測定採用用D（＋）—葡萄糖作標準，苯酚－硫酸法制備標準曲線。
精密稱取D（＋）—葡萄糖0.02g，定容100ml，分別取0，0.4，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8。稀釋至5ml，加入1.0ml苯酚（5％），搖勻靜止，立即加入5.0ml濃H2SO4,5min後，沸水浴15min，冷水冷卻，紫外可見光分光光度計於490nm波長處比色，測定吸光度，做吸光度A與濃度C（ug/ml）線性迴歸方程。
精密稱取樣品0.04g，稀釋定容1000ml，同上法測定其吸光度。
3 結果與討論
3.1實驗結果
3.1.1實驗數據
(1) 提取數據
a. 脫脂：曾選用索氏提取法，現與浸泡法比較如下：
表一 索氏提取法與浸泡法脫脂的比較
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索氏提取法 取30g研磨過的葉片，於虹吸管中加入350ml石油醚，燒瓶中加入400ml，75 oC水浴迴流提取5.5h，提取液顏色爲黃色；倒出提取液，加入新的石油醚迴流提取1h, 石油醚顏色不再加深，停止迴流。石油醚爲淡黃色
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浸泡法 30g研磨過的葉片，用石油醚以15：1（體積：重量）的比例浸泡沙棘葉約24小時，倒出石油醚再以10：1的比例浸泡20～24小時，石油醚浸提液黃色變淡即可。
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優缺點 通過對脫脂後的沙棘葉以及回收石油醚時的剩餘物進行稱量，發覺質量相差甚微，幾乎相等；而且對比石油醚提取液顏色，也相差不大，因而浸泡法操作較索氏提取法更簡單，所以本試驗選取浸泡法對沙棘葉進行脫脂處理。 |
b.醇析:
濃縮液中加入95％的乙醇，使溶液達到不同的醇濃度，其所析出的多糖粗產品如下表：
表二 濃縮液在不同醇濃度下析出的粗糖產品
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編號 ① ② ③ ④ ⑤ |
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沙棘葉（g） 20 20 20 20 20 |
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溶液體積（ml） 50 50 50 50 50 |
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95％醇用量（ml） 55.56 85.7 114.0 266.67 425.0 |
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醇濃度（％） 50.0 60 .0 70 .0 80.0 85.0 |
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產品質量（g） 0.543 0.795 0.805 0.991 1.021 |
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產品外觀 灰色 黑色 灰和黑 灰白 灰白細 小顆粒 小顆粒 小顆粒 細小粉末 小顆粒 |
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產率 (％) 2.7％ 3.975％ 4.025％ 4.952％ 5.105％ |
(2)含量測定數據：
本步驟利用苯酚－硫酸法共測定了兩組數據，所用樣品均爲醇沉濃度爲80%的第④組產品。所得到的數據見下面兩表：
3.1.2結果處理
（1） 相關與直線方程
本實驗採用相關係數與直線迴歸方程來檢驗所測定的數據，相關係數“γ”是測定變量之間相關密切程度和相關方向的代表性指標。但是相關分析不能指出兩變量相互關係的具體形式，也無法從一個變量的變化來推測另一個變量的變化關係。而回歸方程則是通過一定的數學方程來反映變量之間相互關係的具體形式，以便從一個已知量來推測另一個未知量，爲估算預測提供一個重要的方法。
（2） 數據處理
考慮到有幾組平行數據，因此用c語言編程，減少運算量，求得線性迴歸方程與相關係數分別爲：第一組：A=0.00734 +0.61528 C, γ=0.88488
第二組：A=0.009654 +0.603429 C, γ=0.99909
從結果中看出第一組數據中γ明顯不合要求，故採用第二組數據，作出相應的標準曲線圖：
圖五 不同濃度的D（＋）—葡萄糖在490nm波長下與吸光度的標準曲線圖
由圖五可見第二組數據基本呈線性關係，則由標準圖可得樣品中多糖的濃度爲：11.6ug/ml
那麼可以計算出：
a．樣品中總多糖的含量爲：樣品多糖濃度÷樣品濃度×100％
即：11.6÷20×100％＝58％
b．沙棘葉中總多糖的含量：（產品質量×樣品多糖含量）÷沙棘葉質量×100％ 即：（0.991×58％）÷20×100％＝2.84％
3.2討論
3.2.1預處理：沙棘葉的預處理很重要，洗掉塵土，便於產品的純化；葉片不宜過碎，以防熱提取時引起糊化。
3.2.2提取部分
（1） 脫脂：脫脂時間不宜過短或過長，過短脂溶性物質溶解不完全，過長則浪費時間；浸泡時宜少量多次，有利於脫脂
（2） 提取：提取時也是宜於先泡後加熱，少量多次水提取。加熱的溫度不宜過高，80℃即可 ，高溫破壞多糖的活性，低溫不利於提取效率。而濃縮時濃縮爲原體積的1/3即可，便於脫蛋白時節省試劑。
（3） 脫蛋白：a.除蛋白時宜採用sevage法，但需反覆操作。經實驗，劇烈振盪20分鐘，然後攪拌5小時，分液漏斗靜止分層1小時，兩遍即可。採用三氯乙酸法，雖然效果很好，但是反應太劇烈，部分多糖也隨之損耗；b. 將提取液取少量與碘反應，呈陰性，說明多糖中並無澱粉或量很少，並不需要加 α－澱粉酶去除澱粉。
（4） 醇析：用醇沉澱之前應該濃縮至50ml，便於節省醇用量，節省成本。經實驗對比可知隨着醇濃度的加大，粗糖產量也隨之增大，但是80％和90％的醇沉濃度多糖產率相差不多，且高濃度時極有可能沉澱中包含其他大量雜質，但是其醇的用量相差很大，從表二中看出用量相差幾乎一倍。因此從經濟角度考慮，採用80％的醇沉濃度即可。
（5） 乾燥：過濾採用無水乙醇，丙酮洗洗數次，儘量不用乙醚，乙醚的沸點很低易揮發往往帶入空氣中的水分。因此，操作要迅速，且用表面皿蓋住，防止吸取空氣中的水分，否則多糖很容易成爲膠質而變黑變粘，再溶解時需很長時間。真空抽乾時一般不宜採用加熱，因爲多糖很容易炭化。
3.2.2純化分離部分
根據不同分子量的多糖在大孔樹脂中洗脫出來的先後順序，便可分時間段收集不同的單一多糖。再依次進行濃縮，80％濃度的醇沉澱。先進行TLC法初步定性確定多糖成分，再進行核磁共振定性分析，即可檢驗其準確成分。
3.2.3含量測定：a. 5％濃度的苯酚應該用時用30％的苯酚稀釋現配，而30％的苯酚應置於冰箱中避光保存，因爲苯酚易氧化。b.測量吸光度時一定要等到穩定後再讀數，否則偏差很大。c.最後算的多糖含量爲2.84％，這個含量是不低的，很具有開發前景，但是具體是哪幾種多糖，還有待進一步檢驗。
4實驗總結
本實驗首次探討了沙棘葉中粗多糖的提取分離，通過上面實驗的結果可以得出沙棘葉多糖提取分離的最優工藝是：
其多糖含量的測定採用用D（＋）—葡萄糖作標準，苯酚－硫酸法制備標準曲線，求出線性迴歸方程及多糖含量。
在實驗過程中，由於時間不夠多，使得平行實驗做的較少，從而使得數據可能有一定的誤差而沒有進行校正。由於“非典”的嚴重影響，致使後期進行TLC法初步定性確定多糖成分，以及進行核磁共振定性分析，檢驗其準確成分等工作無法如期進行，只有待後人再做進一步的研究。
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