limma包的使用技巧

limmar package是一個功能比較全的包，既含有cDNA芯片的RAW data輸入、前處理（歸一化）功能，同時也有差異化基因分析的“線性”算法（limma: Linear Models for Microarray Data），特別是對於“多因素實驗（multifactor designed experiment）”。limmar包的可擴展性非常強，單通道（one channel）或者雙通道（tow channel）數據都可以分析差異基因，甚至也包括了定量PCR和RNA-seq（第一次見分析microarray的包也能處理RNA-seq）。

limmar package是一個集大成的包，對載入數據、數據前處理（背景矯正、組內歸一化和組間歸一化都有很多種選擇方法）、差異基因分析都有很多的選擇。而且，所設計的線性迴歸和經驗貝葉斯方法找差異基因非常值得學習。

1. 讀入樣本信息

使用函數讀readTargets(file="Targets.txt", path=NULL, sep="\t", row.names=NULL, quote="\"",...)。這個函數其實是一個包裝了的read.table()，讀入的是樣本的信息，創建的對象類似於marray包的marrayInfos和Biobase包的AnnotatedDataFrame。

2. 讀入探針密度數據 

與marray包一致，Bioconductor不能讀入原始的TIFF圖像文件，只能輸出掃描儀輸入的、轉換成數字信號的文本文件。使用函數read.maimages(files=NULL, source="generic", path=NULL, ext=NULL, names=NULL, columns=NULL, other.columns=NULL, annotation=NULL, green.only=FALSE, wt.fun=NULL, verbose=TRUE, sep="\t", quote=NULL, ...)

參數說明：files需要通過函數dir(pattern = "Mypattern")配合正則表達式篩選（規範命名很重要），同時該函數可以讀入符合格式的壓縮過的文件，比如*.txt.gz的文件，這極大的減小的數據儲存大小；source的取值分爲兩類，一類是“高富帥”，比如“agilent”、“spot”等等（下表），它們是特定掃描儀器的特定輸出格式；如果不幸是“屌絲”，即格式是自己規定的，可以選定source="generic"，這時需要規定columns；任何cDNA文件都要有R/G/Rb/Gb四列（Mean或者Median）；annotation可以規定哪些是註釋列；wt.fun用於對點樣點進行質量評估，取值爲0表示這些點將在後續的分析中被剔除，取值位1表示需要保留，對點樣點的評估依賴於圖像掃描軟件的程序設定，比如SPOT和GenePix軟件，查看QualityWeights（現成函數或者自己寫函數）。

讀入單通道數據：讀入單通道數據，可以設定green.only = TRUE即可，然後對應讀入columns = list(G = "Col1", Gb = "Col2")。

讀入的數據，如果是單通道，則成爲EListRaw class；如果是雙通道，則是RGList class。

數據操作：

cbind()：合併數據；

“[”：分割數據；

RGList class有的names是 "R"，"G"，"Rb"，"Gb"，"weights"，"printer"，"genes"，"targets"，"notes"：  R/G/Rb/Gb分別紅和綠的前景和背景噪音；weight是掃描軟件的質量評估；printer是點樣規則（printer layout）；genes是基因註釋；target是樣本註釋；notes是一般註釋。可以通過myRGList$names進行相應的取值和賦值。

3. 前處理

cDNA芯片前處理的流程是：背景去除（background correction）--> 組內歸一化（with-array normalization）--> 組間歸一化（between-array normalization）。最後一步組間歸一化可選，注意trade-off原則。

3.1 背景去除： 

backgroundCorrect(RG, method="auto", offset=0, printer=RG$printer, normexp.method="saddle", verbose=TRUE)

RG：可以是EListRaw，也可以是RGList class；

method：取“auto”，“none”，“subtract”，"half"，"minimum"，"movingmin"，"edwards"或者"normexp"；

normexp.method：在method取“normexp”時，可以取"saddle"，"mle"，"rma"或者"rma75"。

作者建議使用“mle”或者“saddle”，兩個運行速度也差不多。如果數據中含有“形態背景估計（morphological background estimates）”，比如SPOT和GenePix圖像處理軟件，那麼method = "subtract"也就較好的表現。

3.2 組內歸一化

normalizeWithinArrays(object, layout, method="printtiploess", weights=object$weights, span=0.3, iterations=4, controlspots=NULL, df=5, robust="M", bc.method="subtract", offset=0)

method："none"，"median"，"loess"，"printtiploess"，"composite"，"control"和"robustspline"。初始值設定爲“printtiploess”，但是對於Agilent芯片或者小樣本芯片（每個“點樣塊”少於150個探針）。可用選用的loess或者robustspline。“loess歸一化方法假設了有相當大的一部分探針沒有發生差異化表達，而不是上調或者下調的基因數差不多或者差異化程度圍繞着0波動。”（參考文獻1）。需要注意，組內歸一化只是對單張芯片的M值進行了規整（不影響A值），但是對與組間各個通道沒有進行比較。

weight：是圖像處理軟件對探針權重的標記，如果使用weight，那麼在歸一化過程中weight爲0的探針不會影響其他探針，這並不意味着這些探針會被剔除，它們同樣會被歸一化，也會出現在歸一化的結果中。如果不想使用，那麼weight設爲NULL。

iterations：設定loess的循環數，循環數越多，結果越強健（robust）。

3.3 組間歸一化

normalizeBetweenArrays(object, method=NULL, targets=NULL, cyclic.method="fast", ...)

method：“none"，"scale"，"quantile"，"Aquantile"，"Gquantile"，“Rquantile”，“Tquantile”，“cyclicloess”。“scale”對log-ratio數值進行歸一化；“quantile”對密度（intensity）進行歸一化；“Aquantile”對A數值進行歸一化，不調正M數值；"Gquantile"和“Rquantile”則分別對Green和Red通道進行歸一化，適用於Green或者Red爲“參考標準（common reference）”的樣品；“Tquantile”表示樣品分開歸一化或者Green和Red一先一後進行歸一化。

以下是一個cDNA芯片的密度圖，分別爲原始、去背景（method = "normexp", normexp.method="mle"）、組內歸一化（method = "robustspline"）和組間歸一化（method = “quantile”），使用plotDensities()繪製。

4. 線性模型設計（linear model desigh）

“線性模型”主要分析差異化表達基因，使用這種方法需要準備兩個矩陣：“實驗設計矩陣（design matrix）”和“對比矩陣（contrast matrix）”。“實驗設計矩陣”主要用於每張芯片上用的RNA樣品種類，“對比矩陣”主要用於規定實驗組和對照組。

“實驗設計矩陣”：列表示RNA樣品種類，對於oligo芯片或者使用common reference的cDNA芯片（簡稱第一類），列數與不同RNA樣品數恰好相同；行數等於芯片數。對於不同染料對應不同樣品的cDNA芯片（簡稱第二類），列數比RNA樣品數恰好少一，行數等於芯片數（如要要衡量染料效應（dye effect），則列數與第一類相同）。對於第一類芯片，使用model.matrix()函數創建“實驗設計矩陣”：比如oligo芯片model.matrix(~ 0+factor(c(1,1,1,2,2,3,3,3)))表示三類RNA樣品；對於cDNA芯片，modelMatrix(targets,ref="EGFP")創建以“EGFP”爲common reference的矩陣。對於第二類芯片，需要手動創建。

“對比矩陣”通過函數makeContrasts()函數創建。

使用步驟：創建“實驗設計矩陣” --> lmFit() --> 創建“對比矩陣”（此步可選，如正交實驗） -->contrasts.fit()（接上步，可選）--> eBayes() --> topTable()。文檔詳細列出了各種各樣的例子。

 比較有用的例子：

4.1 交換染料的技術重複

===========================================================================

> beta7pq$targets

      FileNames SubjectID  Cy3  Cy5 Date of Blood Draw Date of Scan

1 6Hs.195.1.gpr         1 b7 - b7 +         2002.10.11   2003.07.25

2   6Hs.168.gpr         3 b7 + b7 -         2003.01.16   2003.08.07

3   6Hs.166.gpr         4 b7 + b7 -         2003.01.16   2003.08.07

4 6Hs.187.1.gpr         6 b7 - b7 +         2002.09.16   2003.07.18

5   6Hs.194.gpr         8 b7 - b7 +         2002.09.18   2003.07.25

6 6Hs.243.1.gpr        11 b7 + b7 -         2003.01.13   2003.08.06

         Labels

1 6Hs.195.1.gpr

2   6Hs.168.gpr

3   6Hs.166.gpr

4 6Hs.187.1.gpr

5   6Hs.194.gpr

6 6Hs.243.1.gpr

# 假定這六張芯片每兩兩做技術重複

> design <- c(1, -1, -1, 1, 1, -1)

> corfit <- duplicateCorrelation(beta7pq, design, ndups=1, block = c(1, 1, 2, 2, 3, 3), weight = NULL)

> fit <- lmFit(beta7pq, design, block = c(1, 1, 2, 2, 3, 3), cor = corfit$consensus)

> fit <- eBayes(fit)

> topTable(fit, adjust = "dfr")

           P.Value  adj.P.Val        B

6647  4.870266e-07 0.01129122 5.341680

11025 1.507433e-06 0.01747417 4.663784

4910  9.223463e-06 0.04706320 3.434271

11470 1.054914e-05 0.04706320 3.336518

7832  1.182200e-05 0.04706320 3.252921

22582 1.217992e-05 0.04706320 3.230931

20812 1.939031e-05 0.05662524 2.882772

1755  2.042581e-05 0.05662524 2.843204

21405 2.743542e-05 0.05662524 2.616544

11717 2.833754e-05 0.05662524 2.591458

# 也可以採用以下方法

> design <- modelMatrix(beta7pq$targets, ref = "b7 -")

> design <- cbind(Dye = 1, desigh)

> fit <- lmFit(beta7pq, design)

> colnames(design)[2] <- "b7"

> cont.matrix <- makeContrasts(MUvsWT = b7/2, levels = design)

> fit2 <- contrasts.fit(fit, cont.matrix)

> fit2 <- eBayes(fit2)

> topTable(fit2, adjust = "fdr")

        P.Value  adj.P.Val        B

6647  8.351055e-07 0.01936109 4.430939

11025 3.555781e-06 0.02976803 3.700994

11431 3.851970e-06 0.02976803 3.656632

6211  6.431916e-06 0.03727939 3.362305

11470 2.201258e-05 0.09075900 2.586146

4910  2.495165e-05 0.09075900 2.501700

1755  3.124884e-05 0.09075900 2.347645

7832  3.131780e-05 0.09075900 2.346120

11987 5.008082e-05 0.12764486 2.014907

21859 5.505731e-05 0.12764486 1.946501

#  兩者有些不同，原因可能是第一種方法是專門爲“對稱”的cDNA芯片設計，而第二種是爲非對稱設計。

===========================================================================
4.2 類型2的芯片

參考文獻8.4和8.5節。其中用到了model.matrix()這個函數，什麼意思？

4.3 正交實驗

參考文獻8.6和8.7節。

4.4 將兩個通道分開分析

參考文獻8.8節

5. 做圖

5.1 背景和前景

imageplot(z, layout, low = NULL, high = NULL, ncolors = 123, zerocenter = NULL, zlim = NULL, mar=c(2,1,1,1), legend=TRUE, ...)

z：可以定義R/Rb/G/Gb，也可以是導數；

low/high：規定顏色，比如low = "white" , high = "red"

下圖是一張芯片的綠色前景圖、紅色背景圖和log-ratio圖（M值圖）：

=======================================================

> imageplot(log2(beta7$G[, 1]), beta7$printer, low = "white", high = "green")

> imageplot(log2(beta7$Rb[, 1]), beta7$printer, low = "white", high = "red")

> imageplot(beta7q$M[, 1], beta7$printer)

=======================================================

也可以使用imageplot3by2(RG, z="Gb", prefix=paste("image",z,sep="-"), path=NULL, zlim=NULL, common.lim=TRUE, ...)，將圖以3*2的格式六個一組保存成圖片。

5.2 M-A圖

使用plotMA(MA, array=1, xlab="A", ylab="M", main=colnames(MA)[array], xlim=NULL, ylim=NULL, status, values, pch, col, cex, legend=TRUE, zero.weights=FALSE, ...)畫單個MA圖。但這個函數有些問題，有時畫不出。所以，完全可以自己來畫，比如：

==========================================================

# plot the MAplot befor normalization

> M <- log2((beta7$R[, 1]-beta7$Rb[, 1])/(beta7$G[, 1]-beta7$Gb[, 1]))

> A <- (log2((beta7$R[, 1]-beta7$Rb[, 1]))+log2((beta7$G[, 1]-beta7$Gb[, 1])))/2

> plot(A, M, cex = 0.5)

# we can also plot the MAplot above using marray package

> beta7ma <- as(beta7, "marrayRaw")

> plot(maA(beta7ma)[,1], maM(beta7ma)[, 1])

# plot the MAplot after normalization

> plot(beta7q$A[, 1], beta7q$M[, 1], cex = 0.5)

===========================================================

使用plotPrintTipLoess(object,layout,array=1,span=0.4,...)畫print-tip的MA圖，下圖分別是歸一化前和後的print-tip的MA圖。

使用boxplot()畫盒箱圖，使用plotDensity()畫密度曲線圖。下圖爲原始數據、組內歸一化（method = "normexp", normexp.method="mle"）和組建歸一化（method = "scale"）的盒箱圖。

最後，還可以使用 volcanoplot(fit, coef=1, highlight=0, names=fit$genes$ID, xlab="Log Fold Change", ylab="Log Odds", pch=16, cex=0.35, ...)畫“火山圖”（highlight標記前N個差異基因）；

使用vennDiagram(object, include="both", names, mar=rep(1,4), cex=1.5, lwd=1, circle.col, counts.col, show.include, ...)畫“韋恩圖”；

使用plotMDS()繪製多緯標度圖（multidimensional scaling plot, MDS）。

參考文獻：limma: Linear Models for Microarray Data User’s Guide