(本文於2013.09.04更新）
“差異”是個統計學概念，獲取差異表達基因就要用統計方法，R的統計功能很強大，適合做這樣的事情。 用前面的方法讀取數據：
library(affy) library(tcltk) filters <- matrix(c("CEL file", ".[Cc][Ee][Ll]", "All", ".*"), ncol = 2, byrow = T) cel.files <- tk_choose.files(caption = "Select CELs", multi = TRUE, filters = filters, index = 1) data.raw <- ReadAffy(filenames = cel.files) n.cel <- length(cel.files) # 查看樣品名稱 sampleNames(data.raw)
## [1] "NRID9780_Zarka_2-1_MT-0HCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL" ## [2] "NRID9781_Zarka_2-2_MT-0HCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL" ## [3] "NRID9782_Zarka_2-3_MT-1HCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL" ## [4] "NRID9783_Zarka_2-4_MT-1HCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL" ## [5] "NRID9784_Zarka_2-5_MT-24HCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL" ## [6] "NRID9785_Zarka_2-6_MT-24HCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL" ## [7] "NRID9786_Zarka_2-7_MT-7DCA(SOIL)_Rep1_ATH1.CEL" ## [8] "NRID9787_Zarka_2-8_MT-7DCB(SOIL)_Rep2_ATH1.CEL"
# 簡化一下名稱，設置pData sampleNames(data.raw) <- paste("sample",1:n.cel, sep='') pData(data.raw)$treatment <- rep(c("0h", "1h", "24h", "7d"), each=2) pData(data.raw)
## sample treatment ## sample1 1 0h ## sample2 2 0h ## sample3 3 1h ## sample4 4 1h ## sample5 5 24h ## sample6 6 24h ## sample7 7 7d ## sample8 8 7d
使用rma和mas5方法進行預處理：
eset.rma <- rma(data.raw)
## Background correcting ## Normalizing ## Calculating Expression
eset.mas5 <- mas5(data.raw)
## background correction: mas ## PM/MM correction : mas ## expression values: mas ## background correcting...done. ## 22810 ids to be processed ## | | ## |####################|
1 計算基因表達量
很簡單，用一個exprs函數就可以從eset數據中提取出表達量，得到的數據類型是矩陣。但是應該注意rma的eset結果是經過對數變換的，而mas5的eset結果是原始信號強度。雖然表達量是用對數變換的信號值表示的，但是有些計算過程要用到未經變換的原始值，應該把它們都計算出來：
emat.rma.log2 <- exprs(eset.rma) emat.mas5.nologs <- exprs(eset.mas5) class(emat.rma.log2)
## [1] "matrix"
head(emat.rma.log2, 1)
## sample1 sample2 sample3 sample4 sample5 sample6 sample7 sample8 ## 244901_at 4.04 4.348 4.048 4.052 4.019 3.962 4.03 4.062
head(emat.mas5.nologs, 1)
## sample1 sample2 sample3 sample4 sample5 sample6 sample7 sample8 ## 244901_at 39.79 94.94 57.35 60.23 61.08 55.57 53.95 85.98
emat.rma.nologs <- 2^emat.rma.log2 emat.mas5.log2 <- log2(emat.mas5.nologs)
下面我們僅使用rma的結果做演示。計算平均表達量和差異表達倍數（和0h對照比）：
rm(eset.mas5) rm(emat.mas5.nologs) rm(emat.mas5.log2) #計算平均值，並做對數轉換 results.rma <- data.frame((emat.rma.log2[,c(1,3,5,7)] + emat.rma.log2[,c(2,4,6,8)])/2) #計算表達量差異倍數 results.rma$fc.1h <- results.rma[,2]-results.rma[,1] results.rma$fc.24h <- results.rma[,3]-results.rma[,1] results.rma$fc.7d <- results.rma[,4]-results.rma[,1] head(results.rma, 2)
## sample1 sample3 sample5 sample7 fc.1h fc.24h fc.7d ## 244901_at 4.194 4.050 3.991 4.046 -0.1448 -0.2037 -0.1481 ## 244902_at 4.293 4.159 4.061 3.937 -0.1340 -0.2316 -0.3557
簡單補充介紹一下R語言中取數據子集的三種方法，主要是矩陣和數據框：
- 用下標子集取數據子集::比如上面用到的eset.rma[, c(1,3,5,7)]。由於eset.rma是2維矩陣，eset.rma[, c(1,3,5,7)]的第一維留空（逗號前不寫東西）表示取全部的行，第二維下標的取值爲向量c(1,3,5,7)，表示取1,3,5,7共4列。
- 用行、列名稱取子集::eset.rma[c("244901_at", "244902_at"), ]的第一維（行）是名稱向量爲c("244901_at", "244902_at")，第二維留空，表示取數據中行名稱爲c("244901_at", "244902_at")的所有列。同樣方法可應用在列選取上。
- 用邏輯向量取子集::比如我們要選取results.rma中fc.7d大於0的所有行，分兩步：先產生一個邏輯向量，然後用這個邏輯向量取子集，也可以一步完成。
subset.logic <- results.rma$fc.7d>0 subset.data <- results.rma[subset.logic,]
要注意的是邏輯向量的長度要和相應維度的數據長度一致，邏輯向量中爲TRUE的就保留，FALSE的就丟棄：
length(subset.logic); nrow(results.rma)
## [1] 22810
head(subset.logic)
## [1] FALSE FALSE FALSE FALSE TRUE TRUE
2 選取“表達”基因
很多人可能不做這一步，認爲沒必要。但是理論上說，芯片可以檢測的基因不一定在樣品中都有表達，對於樣本量較小的非“pooled”樣品來說這是肯定的。把芯片上所有基因當成樣本中的表達基因去做統計分析顯然不合適。
選取“表達”基因的方法常見的有兩種，一是使用genefilter軟件包，另外一種是調用affy包的mas5calls()函數。使用 genefilter需要設定篩選閾值，不同的人可能有不同的標準，稍嫌隨機，不夠自動化，不介紹了。mas5calls方法使用探針水平數據（AffyBatch類型數據）進行處理，一般使用沒經過預處理的芯片數據通用性強些，其他參數用默認就可以：
data.mas5calls <- mas5calls(data.raw)
## Getting probe level data... ## Computing p-values ## Making P/M/A Calls
繼續用exprs計算“表達”量，得到的數據只有三個值P/M/A。對於這三個值的具體解釋可以用?mas5calls查看幫助。P爲present，A爲absent，M爲marginal（臨界值）。
eset.mas5calls <- exprs(data.mas5calls) head(eset.mas5calls)
## sample1 sample2 sample3 sample4 sample5 sample6 sample7 sample8 ## 244901_at "A" "P" "P" "A" "P" "P" "A" "P" ## 244902_at "A" "P" "P" "M" "A" "A" "P" "A" ## 244903_at "P" "P" "P" "P" "P" "P" "P" "P" ## 244904_at "A" "A" "A" "A" "A" "A" "A" "A" ## 244905_at "A" "A" "A" "A" "A" "A" "A" "A" ## 244906_at "A" "A" "A" "A" "A" "A" "A" "A"
下面我們把至少一個芯片中有表達的基因選出來：從22810中選出了16005個。
AP <- apply(eset.mas5calls, 1, function(x)any(x=="P")) present.probes <- names(AP[AP]) paste(length(present.probes),"/",length(AP))
## [1] "16005 / 22810"
刪掉一些中間數據很必要：
rm(data.mas5calls) rm(eset.mas5calls)
present.probes是名稱向量，用它進行數據子集提取：
results.present <- results.rma[present.probes,]
3 獲取差異表達基因
生物學數據分析時的"差異"應該有兩個意思，一是統計學上的差異，另外一個是生物學上的差異。一個基因在兩個條件下的表達量分別有3個測量值：99,100,101 和 102,103,104。統計上兩種條件下的基因表達數值是有差異的，後者比前者表達量要大。但生物學上有意義嗎？未必。按平均值計算表達變化上升了3%，能產生什麼樣的生物學效應？這得看是什麼基因了。所以差異表達基因的選取一般設置至少兩個閾值：基因表達變化量和統計顯著性量度（p值、q值等）。
3.1 簡單t-測驗
這種方法不用太多的統計學知識，生物專業的人很容易想到，而且確實有不少人在用。 經常使用的篩選閾值是表達量變化超過2倍，即|log2(fc)|>=log(2)。先簡單看看有沒有：
apply(abs(results.present[,5:7]), 2, max)
## fc.1h fc.24h fc.7d ## 5.309 6.688 6.844
apply是一個很有用的函數，它對數據按某個維度批量應用一個函數進行計算。第一個參數爲向量或矩陣（或者是能轉成向量或矩陣的數據，如數據框），第三個參數表示要使用的函數，第二個參數爲應用的維度。上面語句的意思是對數據 abs(results.present[,5:7]) 按列（第二維）使用統計函數max（計算最大值）。 表達變化超過2倍的基因共有842個：
sum(abs(results.present[,"fc.7d"])>=log2(2))
## [1] 842
選出這842個基因：
results.st <- results.present[abs(results.present$fc.7d)>=log2(2),] sel.genes <- row.names(results.st)
t測驗，並選出p<0.05的差異表達基因：
p.value <- apply(emat.rma.log2[sel.genes,], 1, function(x){t.test(x[1:2], x[7:8])$p.value}) results.st$p.value <- p.value names(results.st)
## [1] "sample1" "sample3" "sample5" "sample7" "fc.1h" "fc.24h" "fc.7d" ## [8] "p.value"
results.st <- results.st[, c(1,4,7,8)] results.st <- results.st[p.value<0.05,] head(results.st, 2)
## sample1 sample7 fc.7d p.value ## 245042_at 8.153 7.021 -1.133 0.01004 ## 245088_at 7.041 5.419 -1.622 0.03381
nrow(results.st)
## [1] 347
通過簡單t測驗方法得到347個表達倍數變化超過2倍的差異表達基因。
3.2 SAM（Significance Analysis of Microarrays）
R軟件包samr可以做這個。得先安裝：
library(BiocInstaller) biocLite("samr")
這種方法流行過一段時間，但由於FDR（錯誤檢出率）控制太差，現在基本不用了。
要用也不復雜。但是注意SAM函數使用的emat表達數據是present.probes篩選出來的“表達”基因子集，如果你用沒有經過篩選的數據，得到的結果會差別很大，不信可以自己試試（這點可能也是這種方法的毛病之一）：
library(samr) samfit <- SAM(emat.rma.nologs[present.probes,c(1,2,7,8)], c(1,1,2,2), resp.type="Two class unpaired", genenames=present.probes)
## perm= 1 ## perm= 2 ## perm= 3 ## perm= 4 ## perm= 5 ## perm= 6 ## perm= 7 ## perm= 8 ## perm= 9 ## perm= 10 ## perm= 11 ## perm= 12 ## perm= 13 ## perm= 14 ## perm= 15 ## perm= 16 ## perm= 17 ## perm= 18 ## perm= 19 ## perm= 20 ## perm= 21 ## perm= 22 ## perm= 23 ## perm= 24 ## ## Computing delta table ## 1 ## 2 ## 3 ## 4 ## 5 ## 6 ## 7 ## 8 ## 9 ## 10 ## 11 ## 12 ## 13 ## 14 ## 15 ## 16 ## 17 ## 18 ## 19 ## 20 ## 21 ## 22 ## 23 ## 24 ## 25 ## 26 ## 27 ## 28 ## 29 ## 30 ## 31 ## 32 ## 33 ## 34 ## 35 ## 36 ## 37 ## 38 ## 39 ## 40 ## 41 ## 42 ## 43 ## 44 ## 45 ## 46 ## 47 ## 48 ## 49 ## 50
SAM函數返回值一個列表結構，可以自己用?SAM看看。差異表達基因的數據在siggenes.table中，也是一個列表結構：
str(samfit$siggenes.table)
## List of 5 ## $ genes.up : chr [1:6748, 1:7] "265483_at" "248583_at" "253183_at" "252409_at" ... ## ..- attr(*, "dimnames")=List of 2 ## .. ..$ : NULL ## .. ..$ : chr [1:7] "Gene ID" "Gene Name" "Score(d)" "Numerator(r)" ... ## $ genes.lo : chr [1:5341, 1:7] "259382_s_at" "248748_at" "249658_s_at" "266863_at" ... ## ..- attr(*, "dimnames")=List of 2 ## .. ..$ : NULL ## .. ..$ : chr [1:7] "Gene ID" "Gene Name" "Score(d)" "Numerator(r)" ... ## $ color.ind.for.multi: NULL ## $ ngenes.up : int 6748 ## $ ngenes.lo : int 5341
上調基因在siggenes.table的genes.up中，下調基因在genes.lo中。從上面的數據結構顯示還可以看到差異表達基因的數量： ngenes.up和ngenes.lo。提取差異表達基因數據：
results.sam <- data.frame(rbind(samfit$siggenes.table$genes.up,samfit$siggenes.table$genes.lo), row.names=1, stringsAsFactors=FALSE) for(i in 1:ncol(results.sam)) results.sam[,i] <- as.numeric(results.sam[,i]) head(results.sam, 2)
## Gene.Name Score.d. Numerator.r. Denominator.s.s0. Fold.Change ## 265483_at 14534 222.3 22.48 0.101 1.989 ## 248583_at 2667 186.8 88.45 0.473 1.670 ## q.value... ## 265483_at 0 ## 248583_at 0
應用表達倍數進行篩選，有861個基因表達變化超過2倍（和前面簡單t測驗結果僅差1個，說明t測驗還是可以的嘛！）：
results.sam <- results.sam[abs(log2(results.sam$Fold.Change))>=log2(2), ] ; nrow(results.sam)
## [1] 861
應用q值篩選，q<0.05只有10個，而q<0.1則有685個，選擇篩選閾值也成了這種方法的一個問題：
#samr的q值表示方式爲%，即5表示5% nrow(results.sam[results.sam$q.val<5,])
## [1] 10
nrow(results.sam[results.sam$q.val<10,])
## [1] 685
3.3 Wilcoxon's signed-rank test
這個方法發表在 Liu, W.-m. et al, Analysis of high density expression microarrays with signed-rank call algorithms. Bioinformatics, 2002, 18, 1593-1599。R軟件包simpleaffy的detection.p.val函數有實現，可以通過pairwise.comparison函數調用：
library(simpleaffy) #注意下面語句中的數據順序 sa.fit <- pairwise.comparison(eset.rma, "treatment", c("7d", "0h"))
pairwise.comparison返回的數據爲simpleaffy自定義的"PairComp"類型，提取數據要用它專門的函數：平均值用means函數獲得，變化倍數（log2）用fc函數獲得，t測驗的p值用tt函數獲得：
class(sa.fit)
## [1] "PairComp" ## attr(,"package") ## [1] "simpleaffy"
results.sa <- data.frame(means(sa.fit), fc(sa.fit), tt(sa.fit)) #選擇有表達的基因 results.sa <- results.sa[present.probes,] head(results.sa, 2)
## X7d X0h fc.sa.fit. tt.sa.fit. ## 244901_at 4.047 4.203 -0.1562 0.43982 ## 244902_at 3.938 4.295 -0.3570 0.05824
colnames(results.sa) <- c("7d", "0h", "fold.change", "p.val") head(results.sa, 2)
## 7d 0h fold.change p.val ## 244901_at 4.047 4.203 -0.1562 0.43982 ## 244902_at 3.938 4.295 -0.3570 0.05824
應用表達倍數篩選得到表達倍數超過2倍的基因數量有862個，應用p值篩選後得到562個差異表達基因：
results.sa <- results.sa[abs(results.sa$fold.change)>=log2(2), ]; nrow(results.sa)
## [1] 862
results.sa <- results.sa[results.sa$p.val<0.05,]; nrow(results.sa)
## [1] 562
3.4 Moderated T statistic
這種方法在R軟件包limma裏面實現得最好。limma最初主要用於雙色（雙通道）芯片的處理，現在不僅支持單色芯片處理，新版還添加了對RNAseq數據的支持，很值得學習使用。安裝方法同前面其他Bioconductor軟件包的安裝。載入limm軟件包後可以用limmaUsersGuide()函數獲取pdf格式的幫助文檔。
limma的功能很多，這裏只看看差異表達基因的分析流程，具體算法原理請參考limma在線幫助和這篇文獻：Smyth G K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments[J]. Statistical applications in genetics and molecular biology, 2004, 3(1): 3.
limma需要先產生一個design矩陣，用於描述RNA樣品：
library(limma) treatment <- factor(pData(eset.rma)$treatment) design <- model.matrix(~ 0 + treatment) colnames(design) <- c("C0h", "T1h", "T24h", "T7d") design
## C0h T1h T24h T7d ## 1 1 0 0 0 ## 2 1 0 0 0 ## 3 0 1 0 0 ## 4 0 1 0 0 ## 5 0 0 1 0 ## 6 0 0 1 0 ## 7 0 0 0 1 ## 8 0 0 0 1 ## attr(,"assign") ## [1] 1 1 1 1 ## attr(,"contrasts") ## attr(,"contrasts")$treatment ## [1] "contr.treatment"
可以看到：矩陣的每一行代表一張芯片，每一列代表一種RNA來源（或處理）。此外，你可能還需要另外一個矩陣，用來說明你要進行哪些樣品間的對比分析：
contrast.matrix <- makeContrasts(T1h-C0h, T24h-C0h, T7d-C0h, levels=design) contrast.matrix
## Contrasts ## Levels T1h - C0h T24h - C0h T7d - C0h ## C0h -1 -1 -1 ## T1h 1 0 0 ## T24h 0 1 0 ## T7d 0 0 1
下一步建立線性模型，並進行分組比較和p值校正：
fit <- lmFit(eset.rma[present.probes,], design) fit2 <- contrasts.fit(fit, contrast.matrix) fit2 <- eBayes(fit2)
先統計一下數量。可以看到：對於T7d-C0h比較組（coef=3），表達變化超過2倍（lfc參數）的基因數爲842個，而變化超過2倍、p<0.05的基因總數爲740個：
nrow(topTable(fit2, coef=3, adjust.method="fdr", lfc=1, number=30000))
## [1] 842
nrow(topTable(fit2, coef=3, adjust.method="fdr", p.value=0.05, lfc=1, number=30000))
## [1] 740
把toTable函數的返回結果存到其他變量就可以了，它是數據框類型數據，可以用write或write.csv函數保存到文件：
results.lim <- topTable(fit2, coef=3, adjust.method="fdr", p.value=0.05, lfc=1, number=30000) class(results.lim)
## [1] "data.frame"
head(results.lim)
## logFC AveExpr t P.Value adj.P.Val B ## 254818_at 6.215 10.363 41.38 7.304e-10 1.169e-05 11.538 ## 254805_at 6.844 7.280 30.81 6.095e-09 4.878e-05 10.431 ## 245998_at 2.778 10.011 25.44 2.411e-08 9.545e-05 9.528 ## 265119_at 4.380 8.282 24.07 3.588e-08 9.545e-05 9.240 ## 256114_at 4.461 7.668 23.92 3.745e-08 9.545e-05 9.208 ## 265722_at -2.913 9.276 -23.91 3.760e-08 9.545e-05 9.205
爲什麼以上幾種方法僅用表達倍數（2倍）篩選得到的數字不大一樣？limma和直接計算的結果都是842個，而simpleaffy和SAM爲862/861個。這是對eset信號值取對數和求平均值的先後導致的，limma先取對數再求平均值，而simpleaffy和SAM是先求平均值再取對數。
3.5 其他方法：
如Rank products方法，在R軟件包RankProd裏實現，方法文獻爲：Breitling R, Armengaud P, Amtmann A, et al. Rank products: a simple, yet powerful, new method to detect differentially regulated genes in replicated microarray experiments[J]. FEBS letters, 2004, 573(1): 83-92.
最後我們保存部分數據備下次使用：
#所有表達基因的名稱 write(present.probes, "genes.expressed.txt") #處理7天的差異表達基因 write.csv(results.lim, "results.lim.7d.csv") #emat.rma.log2 write.csv(emat.rma.log2[present.probes,], "emat.rma.log2.csv")
4 Session Info
sessionInfo()
## R version 3.0.1 (2013-05-16) ## Platform: x86_64-pc-linux-gnu (64-bit) ## ## locale: ## [1] LC_CTYPE=zh_CN.UTF-8 LC_NUMERIC=C ## [3] LC_TIME=zh_CN.UTF-8 LC_COLLATE=zh_CN.UTF-8 ## [5] LC_MONETARY=zh_CN.UTF-8 LC_MESSAGES=zh_CN.UTF-8 ## [7] LC_PAPER=C LC_NAME=C ## [9] LC_ADDRESS=C LC_TELEPHONE=C ## [11] LC_MEASUREMENT=zh_CN.UTF-8 LC_IDENTIFICATION=C ## ## attached base packages: ## [1] parallel tcltk stats graphics grDevices utils datasets ## [8] methods base ## ## other attached packages: ## [1] limma_3.17.22 simpleaffy_2.37.1 gcrma_2.33.1 ## [4] genefilter_1.43.0 samr_2.0 matrixStats_0.8.5 ## [7] impute_1.35.0 ath1121501cdf_2.12.0 AnnotationDbi_1.23.18 ## [10] affy_1.39.2 Biobase_2.21.6 BiocGenerics_0.7.4 ## [13] zblog_0.0.1 knitr_1.4.1 ## ## loaded via a namespace (and not attached): ## [1] affyio_1.29.0 annotate_1.39.0 BiocInstaller_1.11.4 ## [4] Biostrings_2.29.15 DBI_0.2-7 digest_0.6.3 ## [7] evaluate_0.4.7 formatR_0.9 highr_0.2.1 ## [10] IRanges_1.19.28 preprocessCore_1.23.0 R.methodsS3_1.4.4 ## [13] RSQLite_0.11.4 splines_3.0.1 stats4_3.0.1 ## [16] stringr_0.6.2 survival_2.37-4 tools_3.0.1 ## [19] XML_3.98-1.1 xtable_1.7-1 XVector_0.1.0 ## [22] zlibbioc_1.7.0