GEO數據挖掘-第一期-膠質母細胞瘤（GBM）

GEO數據挖掘系列文-第一期-膠質母細胞瘤

文章標題

lncRNAs PVT1 and HAR1A are prognosis biomarkers and indicate therapy outcome for diffuse glioma patients

關鍵詞

膠質母細胞瘤，lncRNA

疾病：神經膠質瘤

1. 星形膠質細胞（astrocytomas）

· Grade I

· Grade II：瀰漫性星形細胞瘤

· Grade III：anaplastic astrocytoma

· Grade IV：膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）

2. 少突膠質細胞（oligodendroglial）

· Grade II

· Grade III

◆ ◆ ◆ ◆ ◆

GEO數據庫編號：GSE4290

研究對象：lncRNA

實驗設計

• 實驗組：77個神經膠質母細胞瘤樣本
• 對照組：23個非腫瘤樣本

結論：在神經膠質母細胞瘤中PVT1和CYTOR基因表達顯著上調, HAR1A和MIAT基因表達顯著下調。

◆ ◆ ◆ ◆ ◆

GEO數據挖掘過程

第一步 下載R包

國外鏡像下載速度很慢，所以下載之前一定要設置好國內鏡像

bioPackages <-c( 
  "stringi",  # 處理字符串
  "GEOquery", # 下載GEO數據
  "limma",    # 差異分析
  "ggfortify", "ggplot2", "pheatmap", "ggstatsplot", "VennDiagram", # 作圖
  "clusterProfiler", "org.Hs.eg.db"                                 # 註釋
)


## 設置軟件包的下載鏡像
local({

  # CRAN的鏡像設置
  r <- getOption( "repos" ); 
  r[ "CRAN" ] <- "https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/CRAN/"; 
  options( repos = r )
  # bioconductor的鏡像設置
  BioC <- getOption( "BioC_mirror" ); 
  BioC[ "BioC_mirror" ] <- "https://mirrors.ustc.edu.cn/bioc/"; 
  options( BioC_mirror = BioC )
})


## 安裝未安裝的軟件包
source( "https://bioconductor.org/biocLite.R" ) #第一次使用bioconductor需要運行
lapply( bioPackages, 
  function( bioPackage ){
    if( !require( bioPackage, character.only = T ) ){
      CRANpackages <- available.packages()
      if( bioPackage %in% rownames( CRANpackages) ){
        install.packages( bioPackage )
      }else{
        BiocInstaller::biocLite( bioPackage, suppressUpdates = FALSE, ask = FALSE)
      }
    }
  }
)

第二步 得到geneID和gene類型的對應關係

這個關係可以從人類的GTF文件中提取出來，GTF可以在這裏下載：https://asia.ensembl.org/info/data/ftp/index.html

下載後的文件經過下面的shell腳本處理，即可以得到基因與基因類型的對應關係

awk '{if(!NF || /^#/){next}}1' /public/reference/gtf/gencode/gencode.v25lift37.annotation.gtf | cut -f9 | sed 's/\"//g'| sed 's/;//g' | awk '{ print $4"\t"$8 }' |awk '{if(/^E/){next}}1'|  awk '{ print $2"\t"$1 }' | sort -k 1 | uniq > gencode.v25lift37.annotation.gtf.gene2type

將處理好的文件導入R中進行後續處理，因爲這篇文章只研究lncRNA，所以要去除編碼蛋白的基因ID

{
  gene2type = read.table( 'gencode.v25lift37.annotation.gtf.gene2type' )
  colnames( gene2type ) = c( "gene", "type" )
}

dim( gene2type )
## [1] 58298     2
## 說明一共有五萬多個基因的對應關係

head( gene2type )
##       gene           type
## 1  5S_rRNA           rRNA
## 2      7SK       misc_RNA
## 3 A1BG-AS1      antisense


sort( table( gene2type$type ) )

## lincRNA    processed_pseudogene    protein_coding
##    7601                   10197             20087

## 說明絕大多數的基因是編碼蛋白的


## 剔除基因類型爲“protein_coding”的對應關係
gene2type = gene2type[ gene2type[,2] != 'protein_coding', ]
length( unique( gene2type$gene ) )
save( gene2type, file = 'Relationship_others_gene.Rdata' )

第三步 下載GEO數據

如果getGEO下載失敗，可以手動在項目主頁進行下載

library( "GEOquery" )
GSE_name = 'GSE4290'
options( 'download.file.method.GEOquery' = 'libcurl' ) #windows系統
gset <- getGEO( GSE_name, getGPL = T )

## getGEO函數會下載GSE項目下的所有子集，得到的gset對象是一個list，‘GSE4290’只有一個項目，之後的實戰會遇到多子集的情況

## ‘getGPL = T’會直接下載註釋平臺，如果報錯，本文最後會附上，其他進行平臺註釋的方法

save( gset, file = 'gset.Rdata' )

第四步 數據集篩選

對樣本進行不同分組，以及探針的選取對之後的差異分析結果都會有影響。

作者研究的是GBM樣本和非腫瘤樣本在lncRNA表達上的差異，所以先取出這180個樣本中的77個GBM樣本和23個非腫瘤樣本

options( stringsAsFactors = F )

load( './gset.Rdata' )
library( "GEOquery" )

## 取表達矩陣和樣本信息表
{
  gset = gset[[1]]
  exprSet = exprs( gset ) ## “GEOquery”包中的exprs函數用來取出表達矩陣
  pdata = pData( gset ) ## “GEOquery”包中的pData函數用來取出樣本信息
  group_list = as.character( pdata[, 35] )
}
dim( exprSet )
## [1] 54613   180
exprSet[ 1:3, 1:5 ]
##           GSM97793 GSM97794 GSM97795 GSM97796 GSM97797
## 1007_s_at  10178.1  10122.9   7826.6  11098.4   8668.9
## 1053_at      388.2    517.5    352.4    609.9    430.1

## 現在就應該對得到的矩陣有這樣一個印象
## 這個矩陣有180列，列名是樣本編號，54613行，行名是探針編號
## 矩陣的內容就是各個樣本對應探針檢測到的表達量
## 探針本身是沒有意義的，所以我們下一步就要將探針轉爲基因名

table( group_list )
## astrocytoma, grade 2       astrocytoma, grade 3      glioblastoma, grade 4                         
##                    7                         19                         77 
## non-tumor    oligodendroglioma, grade 2     oligodendroglioma, grade 3
##        23                            38                             12

## 我們不能通過上面表達矩陣的樣本名知道這個樣本是腫瘤樣本還是非腫瘤樣本
## 而pdata記錄了各個樣本的臨牀信息，就可以通過pdata得到樣本名和樣本類型的對應關係


## 根據上面的group_list，取出研究樣本

## 總結一下就是，這180個病人中astrocytoma分爲了二三期病人
## glioblastoma是膠質母細胞瘤，屬於惡性細胞瘤，只有第四期
## oligodendroglioma也分爲二三期病人
## 其餘樣本爲對照

{
  n_expr = exprSet[ , grep( "non-tumor",         group_list )]
  g_expr = exprSet[ , grep( "glioblastoma",      group_list )]
  a_expr = exprSet[ , grep( "astrocytoma",       group_list )]
  o_expr = exprSet[ , grep( "oligodendroglioma", group_list )]
  
}


## 樣本分組，新的表達矩陣只有normal和gbm樣本
{
  exprSet = cbind( n_expr, g_expr )
  group_list = c(rep( 'normal', ncol( n_expr ) ), 
                 rep( 'gbm',    ncol( g_expr ) ) )
}

dim( exprSet )
exprSet[ 1:5, 1:5 ]
table( group_list )

save( exprSet, group_list, file = 'exprSet_by_group.Rdata')

分組這一步就完成了，下面要去除沒有註釋的探針

並不是每一個探針都是對應lncRNA的，所以我們要用之前的基因和基因類型關係篩選一下，之後再去除沒有註釋的探針

## 篩選探針
GPL = gset@featureData@data ## 第三步getGEO函數下載數據時，直接下載了平臺，GPL就是註釋矩陣的平臺數據
## 也就是探針和基因的對應關係

colnames( GPL )
view( GPL )

## GPL的“ID”列是探針，‘Gene Symbol”列是基因名，將這兩列取出來
ids = GPL[ ,c( 1, 11 ) ]

## ‘Gene Symbol”列格式有些特殊
## 一個探針對應了多個基因
a<-strsplit(as.character(ids[,2]), " /// ")
tmp <- mapply( cbind, ids[,1], a ) 
ID2gene <- as.data.frame( tmp )
colnames( ID2gene ) = c( "id", "gene" )
load( "./Relationship_others_gene.Rdata" )

## 下面一步就是根據gene2type去除平臺中編碼蛋白的基因
ID2gene$type = gene2type[ match( ID2gene[ , 2 ], gene2type[ , 1 ] ), 2 ]

dim(ID2gene)
## [1] 59255     3

save(ID2gene, file = 'ID2gene.Rdata')


load('./ID2gene.Rdata')
load('./exprSet_by_group.Rdata')

## 這一步根據ID2gene去除沒有註釋的探針
{
  exprSet = exprSet[ rownames(exprSet) %in% ID2gene[ , 1 ], ]
  ID2gene = ID2gene[ match(rownames(exprSet), ID2gene[ , 1 ] ), ]
}

## 因爲有些探針對應同一個基因，要將exprSet，ID2gene的探針一致

## 即exprSet有的探針，ID2gene也一定有
## 即ID2gene有的探針，exprSet也一定有

dim( exprSet )
dim( ID2gene )
tail( sort( table( ID2gene[ , 2 ] ) ), n = 12L )

## 相同基因的表達數據取最大值，五萬多個探針，這一步相對會運行較長時間
{
  MAX = by( exprSet, ID2gene[ , 2 ], 
              function(x) rownames(x)[ which.max( rowMeans(x) ) ] )
  MAX = as.character(MAX)
  exprSet = exprSet[ rownames(exprSet) %in% MAX , ]
  rownames( exprSet ) = ID2gene[ match( rownames( exprSet ), ID2gene[ , 1 ] ), 2 ]
}
exprSet = log(exprSet)
dim(exprSet)
exprSet[1:5,1:5]

save(exprSet, group_list, file = 'final_exprSet.Rdata')

進行上訴操作後，基本我們就得到了之後要進行差異分析的數據集了，我們可以先通過聚類分析看一下數據的聚類情況，是否與分組一致

library( "ggfortify" )
## 聚類
{
  colnames( exprSet ) = paste( group_list, 1:ncol( exprSet ), sep = '_' )
  nodePar <- list( lab.cex = 0.3, pch = c( NA, 19 ), cex = 0.3, col = "red" )
  hc = hclust( dist( t( exprSet ) ) )
  png('hclust.png', res = 250, height = 1800)
  plot( as.dendrogram( hc ), nodePar = nodePar, horiz = TRUE )
  dev.off()
}
## 樣本過多，圖就不放了

畫個PCA圖看一下，基本是分開的，少數樣本界限不清。

如果樣本量過少，對於主成分分析結果與分組不一致的樣本，可以選擇捨去

## PCA
data = as.data.frame( t( exprSet ) )
data$group = group_list
png( 'pca_plot.png', res=80 )
autoplot( prcomp( data[ , 1:( ncol( data ) - 1 ) ] ), data = data, colour = 'group', 
          label =T, frame = T) + theme_bw()
dev.off()

第五步 差異分析-limma包

load( "./final_exprSet.Rdata" )

library( "limma" )
{
  design <- model.matrix( ~0 + factor( group_list ) )
  colnames( design ) = levels( factor( group_list ) )
  rownames( design ) = colnames( exprSet )
}
design

contrast.matrix <- makeContrasts( "gbm-normal", levels = design )
contrast.matrix

## design和contrast.matrix都是爲了下面的差異分析製作的

load( "./ID2gene.Rdata" )
{
  fit <- lmFit( exprSet, design )
  fit2 <- contrasts.fit( fit, contrast.matrix ) 
  fit2 <- eBayes( fit2 )
  nrDEG = topTable( fit2, coef = 1, n = Inf ) 
  write.table( nrDEG, file = "nrDEG.out")
}
head(nrDEG)

到這裏差異分析就結束了，我們畫個熱圖看一下效果

library( "pheatmap" )
{
  choose_gene = head( rownames( nrDEG ), 50 )
  choose_matrix = exprSet[ choose_gene, ]
  choose_matrix = t( scale( t( exprSet ) ) )
  annotation_col = data.frame( CellType = factor( group_list ) )
  rownames( annotation_col ) = colnames( exprSet )
  pheatmap( fontsize = 2, choose_matrix, annotation_col = annotation_col, show_rownames = F, 
            annotation_legend = F, filename = "heatmap.png")
}

畫個火山圖看一下

library( "ggplot2" )
logFC_cutoff <- with( nrDEG, mean( abs( logFC ) ) + 2 * sd( abs( logFC ) ) )
logFC_cutoff
logFC_cutoff = 1 ## 文章中設置爲1

{
  nrDEG$change = as.factor( ifelse( nrDEG$P.Value < 0.05 & abs(nrDEG$logFC) > logFC_cutoff,
                                  ifelse( nrDEG$logFC > logFC_cutoff , 'UP', 'DOWN' ), 'NOT' ) )

  save( nrDEG, file = "nrDEG.Rdata" )

  this_tile <- paste0( 'Cutoff for logFC is ', round( logFC_cutoff, 3 ),
                       '\nThe number of up gene is ', nrow(nrDEG[ nrDEG$change =='UP', ] ),
                       '\nThe number of down gene is ', nrow(nrDEG[ nrDEG$change =='DOWN', ] ) )

  volcano = ggplot(data = nrDEG, aes( x = logFC, y = -log10(P.Value), color = change)) +
                   geom_point( alpha = 0.4, size = 1.75) +
                   theme_set( theme_set( theme_bw( base_size = 15 ) ) ) +
                   xlab( "log2 fold change" ) + ylab( "-log10 p-value" ) +
                   ggtitle( this_tile ) + theme( plot.title = element_text( size = 15, hjust = 0.5)) +
                   scale_colour_manual( values = c('blue','black','red') )
  print( volcano )
  ggsave( volcano, filename = 'volcano.png' )
  dev.off()
}

第六步 表達顯著基因在不同腫瘤中的表達量

作者挑出PVT1 CYTOR HAR1A MIAT這四個基因，畫出他們在不同的腫瘤中的表達量

library( "ggstatsplot" )
load( './final_exprSet.Rdata' )
special_gene = c( 'PVT1', 'LINC00152', 'HAR1A', 'MIAT' )

## CYTOR的別名是LINC00152

for( gene in special_gene ){
  filename <- paste( gene, '.png', sep = '' )
  TMP = exprSet[ rownames( exprSet ) == gene, ]
  data = as.data.frame(TMP)
  data$group = group_list
  p <- ggbetweenstats(data = data, x = group,  y = TMP )
  ggsave( p, filename = filename)
}