光學顯微鏡分辨率極限

原創

2020-02-22 21:04

概述

按照幾何光學定律，只要適當地選擇透鏡的焦距，就可以造出極高放大倍數的光學系統，將任何微小的物體放大到清晰可見的程度。但實際上做不到。光具有波粒二象性，按照波動光學，光學顯微鏡放大倍率受可見光波長的限制，即便使用超高倍率，在顯微鏡下看的無非是模糊的像，沒有意義。19世紀末，德國物理學家恩斯特·阿貝指出，光學顯微鏡受限於光的衍射效應，存在分辨率極限（也稱阿貝極限），其數值大約是可見光波長的一半。而可見光的波長範圍如下圖所示，波長最短的爲藍紫光，約400nm，因此光學顯微鏡最小分辨率極限爲200nm。當兩個點距離小於200nm，光學顯微鏡無法分辨。

分辨率極限原理

顯微鏡使用的是凸透鏡，按照經典幾何光學理論，凸透鏡能將入射光聚焦到它的焦點上，但由於透鏡口徑有一定大小，光線透過時會由於波動特性會發生衍射，無法將光線聚成無限小的焦點上，而只會形成一定能量分佈的光斑。中央是明亮的圓斑，周圍有一組較弱的明暗相間的同心環狀條紋，把其中以第一暗環爲界限的中央亮斑稱爲艾裏斑（airy disk）。
每一個發光的物點，經過有限直徑的透鏡後，都會在像平面形成一個艾裏斑。對於非常接近的兩個點，成像後艾裏斑會過於接近，以至於無法分辨。若兩個等光強的非相干點像之間的間隔等於艾裏斑的半徑，即一個艾裏斑中心與另一個艾裏斑邊緣正好重合時，這兩個物點剛好能被人眼或光學儀器所分辨，這個判據叫做瑞利判據（Rayleigh Criterion）。
滿足瑞利判據的兩個艾裏斑中心的角間距，或者兩發光物點對透鏡光心得張角叫做最小分辨角
$\varphi=\frac{1.22\lambda}{D}$
其中 $λ$ 爲波長， $D$ 爲通光孔的直徑。從公式可以看出，當光的波長無限減小或者通光孔的直徑無限增大，光的波動性就逐漸減弱，這就回到經典幾何光學的結論，理想光學系統分辨率是無窮小的。當然，這兩種情況在現實中都是不存在的，所以理想光學系統一定會受到波動性的影響，存在分辨率極限。
由於顯微鏡放大倍率較大，物距 $L$ 接近於焦距 $f$ ，顯微鏡分辨率用物點可分辨的距離表示
$\sigma = \varphi L=\varphi f=\frac{1.22\lambda f}{D}$
以 $\frac{D}{2f} \approx sin\alpha$ 帶入上式（ $α$ 是孔徑角的一半），並考慮到物鏡空間折射率 $n$ 影響，得到阿貝方程（Abbe’s equation）
$\sigma = \frac{1.22\lambda}{2nsin\alpha}=\frac{0.61\lambda}{NA}$
其中 $NA$ 表示數值孔徑， $NA=nsin\alpha$ ，數值孔徑越大，分辨率越高。
亥姆霍茲和阿貝針對不發光的點（即被照明的點）研究後，給出相應的分辨率公式：
$\sigma=\frac{\lambda}{NA}$
在斜射光照明時，分辨率的公式爲
$\sigma=\frac{0.5\lambda}{NA}$
當顯微鏡物方介質爲空氣時，折射率 $n=1$ ，物鏡最大的數值孔徑爲1

顯微鏡分辨提升

病毒、生物大分子的尺度都小於200納米，光學顯微鏡沒法看到它們。要突破光學顯微鏡的極限，就要使用比可見光波長還短的波來觀測，例如紫外線、X射線，還有電子束。沒錯，電子束也能形成波，只不過波長極短，這使得電子顯微鏡的分辨率能夠達到0.2納米，放大上百萬倍。
但是在目前的科研中，光學顯微技術仍舊是不能取代的。電子顯微鏡的工作原理是把可見光換成了電子束，相當於是降低了Abbe方程中的波長這一項，從而取得了更高的分辨率。但是電子顯微鏡存在它本身的問題：操作複雜、設備昂貴且笨重、製備觀察樣本麻煩、不能觀察活樣本。這些問題導致電子顯微鏡在很多科研領域不能完全替代光學顯微鏡。