1. GWAS筆記操作計劃
之前的教程中，我們使用的是別人模擬的數據，數據類型是二分類數據，這裏我們模擬一個數量性狀的連續性狀，做GWAS更有代表性。
我們先從沒有協變量的一般線性模型（LM）模型開始，然後加入數據類型的協變量，然後加入因子類型的協變量（這裏需要進行虛擬變量的轉化），然後將數值協變量和因子變量放在一起作爲協變量，然後將PCA的值作爲協變量加進去，這樣一般線性模型分析完成。
最後我們使用混合線性模型（LMM），不考慮協變量，然後加入協變量，然後將PCA加入協變量。
最最後介紹一下可視化，包括曼哈頓圖，QQ圖，LD衰減圖等相關可視化。
最最最後，介紹一下這個數據，用這麼多數據分析後，哪種模型最好，哪種模型控制假陽性較好，哪種模型控制假陰性較好。
最最最最後，介紹一下結果的中有疑問的地方，比如爲何有些SNP顯著但是效應較小，有些SNP效應較大但是顯著性較低？比如GWAS分析結果中效應值是怎麼理解的？GWAS分析的效應值和rrBLUP中SNP效應值有什麼關係？
計劃章節：
筆記 GWAS 操作流程4-1：LM模型assoc（本篇）
主要是介紹assoc和linear兩個參數，不考慮協變量，然後將結果與R語言編程結果比較
筆記 GWAS 操作流程4-2：LM模型linear+數值協變量
主要是介紹linear參數，考慮數值協變量，然後將結果與R語言編程結果比較
筆記 GWAS 操作流程4-3：LM模型linear+因子協變量
主要是介紹linear參數，考慮因子協變量，然後將結果與R語言編程結果比較
筆記 GWAS 操作流程4-4：LM模型linear+數值+因子協變量
主要是介紹linear參數，考慮數值+因子協變量，然後將結果與R語言編程結果比較
筆記 GWAS 操作流程4-5：LM模型linear+數值+因子+PCA協變量
主要是介紹linear參數，考慮數值+因子協變量，然後將結果與R語言編程結果比較
筆記 GWAS 操作流程5-1：LMM模型進行GWAS分析
主要是介紹混合線性模型，不考慮協變量結果分析
筆記 GWAS 操作流程5-2：LMM模型進行GWAS分析+數值協變量
主要是介紹混合線性模型，考慮數值協變量結果分析
筆記 GWAS 操作流程5-3：LMM模型進行GWAS分析+因子協變量
主要是介紹混合線性模型，考慮因子協變量結果分析
筆記 GWAS 操作流程5-4：LMM模型進行GWAS分析+數值+因子協變量
主要是介紹混合線性模型，考慮數值+因子協變量結果分析
筆記 GWAS 操作流程5-5：LMM模型進行GWAS分析+數值+因子+PCA協變量
主要是介紹混合線性模型，考慮數值+因子+PCA協變量結果分析
筆記 GWAS 操作流程6-1：GWAS分析中曼哈頓圖的繪製
主要是介紹GWAS分析中曼哈頓圖的繪製
筆記 GWAS 操作流程6-2：GWAS分析中QQ的繪製
主要是介紹GWAS分析中QQ圖的繪製
筆記 GWAS 操作流程6-3：GWAS分析中其它圖的繪製
主要是介紹GWAS分析中其它圖的繪製
筆記 GWAS 操作流程7：GWAS分析中結果解讀
主要是介紹GWAS分析中結果解讀
2. 模擬的數據
模擬數據使用QMSim軟件，模擬的數據如下：
b.map b.ped cov.txt phe.txt
這裏b.map和b.ped是plink格式的數據，cov.txt爲協變量，phe.txt爲觀測值
數據預覽：
b.map數據：
b.ped數據：
cov.txt 協變量數據：
phe.txt表型數據：
3. plink利用assoc進行LM的GWAS分析
plink --file b --pheno phe.txt --assoc --out re --allow-no-sex
代碼解釋：
- –file爲plink的文件名的前綴
- –pheno 爲plink分析GWAS的表型數據，注意前兩列爲FID IID，第三列爲分析的性狀
- –assoc 利用的是LM模型
- –out 輸出文件名
- –allow-no-sex 因爲數據中沒有性別信息，需要加上這個參數，允許沒有性別的數據
運行日誌：
PLINK v1.90b6.17 64-bit (28 Apr 2020) www.cog-genomics.org/plink/1.9/
(C) 2005-2020 Shaun Purcell, Christopher Chang GNU General Public License v3
Logging to re.log.
Options in effect:
--allow-no-sex
--assoc
--file b
--out re
--pheno phe.txt
7820 MB RAM detected; reserving 3910 MB for main workspace.
.ped scan complete (for binary autoconversion).
Performing single-pass .bed write (10000 variants, 1500 people).
--file: re-temporary.bed + re-temporary.bim + re-temporary.fam written.
10000 variants loaded from .bim file.
1500 people (0 males, 0 females, 1500 ambiguous) loaded from .fam.
Ambiguous sex IDs written to re.nosex .
1500 phenotype values present after --pheno.
Using 1 thread (no multithreaded calculations invoked).
Before main variant filters, 1500 founders and 0 nonfounders present.
Calculating allele frequencies... done.
10000 variants and 1500 people pass filters and QC.
Phenotype data is quantitative.
Writing QT --assoc report to re.qassoc ... done.
結果文件：
re.qassoc
注意，這裏的SNP沒有質控，有很多SNP沒有分型，所以結果又很多NA，不過這裏可以看出assoc分析GWAS的結果，其中SNP中M7和M9的結果：
- M7，beta值爲1.394，se爲1.317，R2位0.000749，T值爲1.059，P值爲0.2898
- M9，beta值爲3.327，se爲1.504，R2位0.003254，T值爲2.211，P值爲0.02715
4. plink利用linear進行LM的GWAS分析
這裏，利用linear和上面的assoc命令類似，將linear代替assoc即可。一般來說，linear可以支持協變量，assoc不支持協變量。assoc運行速度快於linear。
plink --file b --pheno phe.txt --allow-no-sex --linear --out re
運行日誌：
PLINK v1.90b6.17 64-bit (28 Apr 2020) www.cog-genomics.org/plink/1.9/
(C) 2005-2020 Shaun Purcell, Christopher Chang GNU General Public License v3
Logging to re.log.
Options in effect:
--allow-no-sex
--file b
--linear
--out re
--pheno phe.txt
7820 MB RAM detected; reserving 3910 MB for main workspace.
.ped scan complete (for binary autoconversion).
Performing single-pass .bed write (10000 variants, 1500 people).
--file: re-temporary.bed + re-temporary.bim + re-temporary.fam written.
10000 variants loaded from .bim file.
1500 people (0 males, 0 females, 1500 ambiguous) loaded from .fam.
Ambiguous sex IDs written to re.nosex .
1500 phenotype values present after --pheno.
Using 1 thread (no multithreaded calculations invoked).
Before main variant filters, 1500 founders and 0 nonfounders present.
Calculating allele frequencies... done.
10000 variants and 1500 people pass filters and QC.
Phenotype data is quantitative.
Writing linear model association results to re.assoc.linear ... done.
結果文件：
re.assoc.linear
結果和assoc的結果完全一致！
5. 使用R語言的一般線性迴歸比較結果
這裏，需要將plink轉化爲012的形式，可以使用recodeA參數：
plink --file b --recodeA --out c
結果：
c.raw
編寫R程序：
library(data.table)
geno = fread("c.raw",header=T)
geno[1:10,1:20]
phe = fread("../phe.txt")
head(phe)
dd = data.frame(phe$V3,geno[,7:17])
head(dd)
mod_M7 = lm(phe.V3 ~ M7_1,data=dd)
summary(mod_M7)
可以看出R語言lm的結果中：
M7: beta爲1.3940， se爲1.3165，t值爲1.059，p值爲0.290，
M9：beta爲3.3265，se爲1.5042，t值爲2.211，p值爲0.0272
對比assoc的結果：
可以看出，兩者結果完全一致。
問題來了：
如果R中跑完10000個標記的迴歸分析，需要很長時間，而plink只需要幾秒。沒有比較久沒有傷害。不過R適合驗證性的分析，比如你在進行plink分析時，看到LM模型，說明書上寫的是迴歸分析，但是你用R語言編寫後，驗證了這是lm迴歸分析，這種喜悅是什麼？
這種喜悅就是，明知屁是臭的，偏偏還要聞一下。雖然很多人告訴你是臭的，但還是想要自己聞一下。所謂“紙上得來終覺淺，絕知此事要躬行”便是如此啊，聞過之後，可以告訴別人說：“真香！”
起碼我自己的收穫：
1，知道GWAS分析中，plink進行LM分析，SNP轉化爲012,0是major，2是minor，這順序是不能變的，你如果要手動進行迴歸分析，需要將SNP的分型進行轉化，而不是粗暴的將其替換爲0,1，2.
2，R在進行單個SNP的分析時，0,1，2是作爲數值進行的迴歸分析，而不是因子。
最後感言：
真香！