掠食性粘細菌通過調節土壤微生物羣落來控制黃瓜枯萎病
A predatory myxobacterium controls cucumber Fusarium wilt by regulating the soil microbial community
Microbiome
Impact Factor 10.465
DOI：https://doi.org/10.1186/s40168-020-00824-x
發表日期：2020-04-06
第一作者：葉現豐1†,李周坤1†
通訊作者：崔中利1,4，張瑞福5
合作作者：Xue Luo, Wenhui Wang, Yongkai Li, Rui Li, Bo Zhang, Yan Qiao, Jie Zhou, Jiaqin Fan,Hui Wang,Yan Huang,Hui Cao,
主要單位：
1南京農業大學生命科學學院(Key Laboratory of Agricultural Environmental Microbiology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, College of Life Science of Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, People’s Republic of China)
4南京農業大學植物免疫重點實驗室(Key Laboratory of plant immunity, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, People’s Republic of China)
5中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所(Key Laboratory of Microbial Resources Collection and Preservation, Ministry of Agriculture, Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, People’s Republic of China)
寫在前面
分享標題：Microbiome：南農大團隊在粘細菌捕食的生態學功能方面取得重要進展
關鍵字：粘細菌，微捕食者，珊瑚球菌EGB，黃瓜尖孢鐮刀菌，土壤微生物組，根系分泌物，共現網絡
新聞稿
Microbiome：
南農大崔中利團隊在粘細菌捕食的生態學功能方面取得重要進展
http://lfc.njau.edu.cn/biocontent.asp?nid=7415&leibie=n065
摘要
背景
粘細菌是土壤生態系統中的微捕食者，具有協同移動和覓食的能力。一些粘細菌菌株已被用於控制土壤傳播的真菌植物病原體。然而，粘細菌，植物病原體和土壤微生物組之間的相互作用在很大程度上尚未被探索。在這項研究中，我們旨在調查粘細菌珊瑚球菌菌株EGB在土壤中的行爲及其對接種黃瓜後(以控制由尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum(FOC))引起的黃瓜枯萎病)對土壤微生物組的影響。
結果
溫室和兩年的田間試驗表明，固態發酵菌株EGB顯著降低了黃瓜枯萎病，其中79.6％(溫室)，66.0％(2015年，田間)和53.9％(2016年，田間)。EGB菌株很好地適應了土壤環境，有效降低了土傳FOC的含量。對土壤微生物羣落的時空分析表明，菌株EGB通過趨化作用向黃瓜植物的根和根分泌物遷移。對土壤微生物組的共現網絡分析表明，施加菌株EGB後，模塊數和羣落數減少，但每個節點的連接數增加。幾種捕食性細菌，如Lysobacter，Microvirga，和Cupriavidus表現爲hubs 或indicators節點，顯示與其他細菌的緊密連接。
結論
掠食性粘細菌Corallococcus sp. (珊瑚球菌)EGB菌株通過遷移到植物根部並調節土壤微生物羣落來控制黃瓜枯萎病。該菌株有潛力被開發爲土傳枯萎病的新型生物防治劑。
結果
表 1 EGB菌種固體培養的應用對黃瓜枯萎病發病率以及黃瓜根系周圍土壤中FOC和EGB菌種數量的影響
Effects of strain EGB solid culture application on the disease incidences of cucumber Fusarium wilt, and quantities of strains FOC and EGB in soil surrounding cucumber roots
在溫室實驗中，每種處理均重複3次，數據代表3次重複的均值和標準差(均值±標準差)。在同一列中，根據Duncan檢驗，用相同字母指定的值沒有顯着差異(p ≤ 0.05)。
NT，無FOC或菌株EGB固體培養；EGB，僅EGB菌株固體培養；EGBFOC，FOC和EGB固體培養；FOC，僅FOC
圖1 EGB菌株在黃瓜枯萎病防治中的兩年田間表現
Two-year field performance of strain EGB in the control of cucumber Fusarium wilt
EGB菌株在黃瓜枯萎病防治中的兩年田間表現。2015年使用EGB菌株一個月後黃瓜的生長；a未經處理的對照，b EGB液體培養和c EGB固體培養。B，C 2015年(B)和2016年(C)的枯萎病發病率的統計分析。每種處理中的200個黃瓜隨機分爲四個塊，誤差棒表示四次重複的平均值的標準偏差。根據Duncan檢驗，用相同字母表示的值沒有顯着差異(p≤0.05)。
圖2 取樣策略和Corallococcus 和Fusarium 的相對時空丰度
Sampling strategy and relative spatiotemporal abundances of Corallococcus and Fusarium
取樣策略(a)和(珊瑚球菌)Corallococcus(b)和鐮刀菌(c)的相對時空丰度。I，菌株EGB接種部位；R，根部周圍的採樣點；M，黃瓜根與接種部位之間的部位；
NT，無FOC或菌株EGB固體培養；EGB，僅EGB菌株固體培養；EGBFOC，FOC和EGB固體培養；FOC，僅FOC
每個樣品重複3次，誤差棒代表三個重複試驗的平均值的標準偏差。根據Duncan檢驗，用相同字母表示的值沒有顯著差異(p ≤ 0.05)
圖3 EGB菌株對TPM板上黃瓜根分泌物的趨化性
Chemotaxis of strain EGB towards cucumber root exudates on TPM plates
EGB菌株對TPM板上黃瓜根分泌物的趨化性。aEGB對化學物質的趨化反應示意圖。b用檸檬酸進行趨化性試驗的可行性測試。c菌株EGB對黃瓜根分泌物的趨化性。RE，黃瓜的根分泌物；黑色箭頭，出現不對稱羣集的位置；白色箭頭，是滴落化學藥品的位置；紅色虛線，菌株EGB羣集定殖的邊緣。實驗重複了四次，每次重複三遍。
表2 EGB菌株對黃瓜根分泌物中13種化合物的趨化反應
The chemotactic response of strain EGB to 13 compounds in cucumber root exudates
EGB菌株對黃瓜根分泌物中13種化合物的趨化反應。“+”，趨化反應陽性，多個+表示趨化反應強度；“-”，無趨化反應。重複三次實驗，重複三個樣品。
圖4 EGB菌株對黃瓜根的定殖
Colonization of cucumber roots by strain EGB
EGB菌株對黃瓜根的定殖。a，c和e 黃瓜根的分生區。b，d和f 黃瓜根的伸長區。a，b 空白TPM緩衝對照。c，d 大腸桿菌DH10B陰性對照。e，f EGB處理。箭頭，大腸桿菌DH10B或菌株EGB的細胞。
圖5 土壤細菌和真菌羣落的主成分分析
Principal component analysis of the soil bacterial and fungal communities
土壤細菌(a)和真菌(b)羣落的主成分分析。NT，無FOC或菌株EGB固體培養；EGB，僅EGB菌株固體培養；EGBFOC，FOC和EGB固體培養；FOC，僅FOC。R，根部周圍的採樣點；M，接種部位和黃瓜根之間的部位；15，第15天取樣的土壤；27，第27天取樣的土壤。
表3 微生物組網絡的相關性和拓撲特性
Correlation and topological properties of the microbiome networks
R，黃瓜根周圍土壤樣品；M，從黃瓜根和接種部位之間的部位取樣的土壤；15th day，第15天取樣的土壤；27th day, ，第27天取樣的土壤；NT，無FOC或菌株EGB固體培養；EGB，僅EGB菌株固體培養；EGBFOC，FOC和EGB固體培養；FOC，僅FOC
a微生物分類羣（屬水平）至少具有一種顯着(p <0.001)和強相關性(r> 0.7或≤0.7)。R語言和corr.test()用於相關性分析。
b通過R語言分析獲得的連接數(R 2017, 4version 3.5.3)
c兩個微生物類羣之間的正相關(> 0.7，p <0.01)
d兩個微生物類羣之間的負相關(≥ 0.7，p <0.01)
e節點之間具有高密度連接的結構(由Gephi推斷)
f羣落定義爲內部緊密連接的一組節點(Gephi)
g網絡中節點之間的最長距離，以邊數測量(Gephi)
h所有節點對之間的平均網絡距離或網絡中所有邊的平均長度(Gephi)
i網絡中每個節點的平均連接數(Gephi)
j平均聚類係數定義爲各個係數的平均值(Gephi)
k用於測量網絡完成程度的密度。完整的圖具有所有可能的邊和密度等於1(Gephi)
圖6 不同土壤樣本中細菌羣落的網絡共現分析
Network cooccurrence analysis (Spearman |ρ| > 0.7 and p< 0.001)of bacterial communities from different soil samples
不同土壤樣本中細菌羣落的網絡共現分析(Spearman |ρ| > 0.7 and p<
0.001)。每個結點代表屬的分類水平(基於16S rRNA)，結點的大小與樣品中屬水平的相對丰度成正比。紅線表示正相關，藍線表示負相關。線寬代表相關程度。捕食性細菌用黃色框標記。R，根部周圍的採樣點；M，接種部位和黃瓜根之間的部位；NT，無FOC或菌株EGB固體培養；EGB，僅EGB菌株固體培養；EGBFOC，FOC和EGB固體培養；FOC，僅FOC；15th day，第15天取樣的土壤；27th day，第27天取樣的土壤。
討論
溫室實驗表明，粘細菌是有望的潛在生物防治劑，可有效控制無菌泥炭或土壤中樹苗的腐爛病，黃瓜枯萎病和辣椒中的炭疽病。但是，尚未進行田間試驗來評估蔬菜作物的土傳真菌病原體的粘細菌生物防治。在黃瓜田間試驗中，菌株EGB固體培養物有效降低了青枯病的發病率。qPCR分析表明，EGB菌株非常適合土壤環境。在實驗結束時，黃瓜根周圍土壤中的菌株EGB數量保持在每克土壤中105–106個拷貝，這是BCAs保護植物的關鍵水平。觀察到FOC對Corallococcus(珊瑚球菌)的誘導，表明粘細菌與FOC之間存在相互作用。但是，它的數量比菌株EGB處理的數量少1.1-1.6個數量級。有效的定殖和在植物根部形成生物膜樣結構對於通過植物根際促生菌(PGPR)進行植物病害的生物防治至關重要。熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)CHA0中增強的生物膜形成顯著增強了胡蘿蔔根的定殖並導致混合接種物與根際之間更穩定的相互作用。在水培試驗中，EGB菌株定殖在根部伸長區並顯示出可見的生物膜狀結構。粘細菌分泌大量胞外基質，可促進生物膜形成和根部定殖。粘細菌以其它土壤微生物爲食的能力導致這些細菌的繁殖並減少了獵物的數量。但是，傳統的BCAs必須與本地微生物羣落競爭資源才能在土壤中生存，這降低了它們的適應能力。
細菌在土壤中的移動會嚴重影響其定殖效率，微生物適應性以及細菌介導的生物防治能力。鞭毛以趨化或羣集的形式驅動主動運動。我們發現完整的趨化性和成羣的運動機制對於PGPR到達和定殖於植物根部很重要。高能動性突變增強了熒光假單胞菌(P. fluorescens)F113對苜蓿根表面的定殖並提高了其生物防治活性。Gao等人進一步表明，羣聚在枯草芽孢桿菌(B. subtilis)的根定殖中起着重要的作用。然而，鞭毛驅動的運動在潮溼的土壤中受到限制。時空高通量測序揭示了菌株EGB向黃瓜根的劇烈運動。對於菌株EGB，觀察到從接種部位到根部移動了8cm。儘管粘細菌缺乏鞭毛並且不能在液體環境中游泳，但是這些生物在協調的細胞羣中或作爲獨立個體在固體表面上滑動。由粘着斑複合物驅動的這種滑動運動使粘細菌細胞在相對乾燥和堅硬的土壤基質上滑動。
我們推測黃瓜的根系分泌物吸引了土壤中EGB菌株的運動。許多研究表明，對根系分泌物的趨化性是根系細菌定殖的第一步。植物分泌的有機酸，氨基酸，糖，季銨鹽和次生代謝產物都是有益細菌的潛在趨化因子。我們的結果表明，根系分泌物也可能吸引EGB菌株。詳細分析表明，根系分泌物中的幾種化合物誘導了EGB菌株的趨化運動。麥芽糖和麥芽糖醇是最有效的化學吸引劑，在低濃度(10μM)下能吸引菌株EGB。已確定麥芽糖是黃瓜和其他植物根系分泌物中的重要化合物。儘管粘細菌對小的可溶性化學物質的趨化性值得懷疑，但由菌毛爲基礎的單細胞“抽搐運動”驅動的趨化性已被證明對銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的生物膜發育很重要。這項研究確定了黏細菌對根分泌液中的糖的趨化作用，這以前未見報道，可能在EGB菌株對黃瓜根的定殖中起重要作用。麥芽糖在粘細菌-根相互作用中的作用值得在未來的研究中進一步研究。
根際微生物組對植物生長，營養和健康至關重要。抑病型土壤爲保護農作物免受土傳病原體感染提供了最好的例子。抑病型土壤的發展可以通過長期的單一栽培或有機改良劑來誘導。在抑病型土壤中發現了獨特的細菌羣落。詳細分析表明，特定的細菌菌株在土傳疾病的抑制中起作用。從抑病型土壤中分離出的假單胞菌(Pseudomonas)和鏈黴菌(Streptomyces)可產生抑制馬鈴薯中的根瘤菌衰減和草莓中枯萎病的抗生素。但是，由於與本地土壤微生物組競爭，從抑制性土壤中分離出的許多微生物無法建立或存活於土壤中或植物根部。拮抗菌株的再引入輕微或短暫地改變了植物的微生物羣並在大規模農業應用中取得了有限的成功。噬菌體的原生生物已被證明是土壤微生物組中的中心樞紐，並導致了該地區某些細菌類羣的罕見。
作爲一種掠食性細菌，EGB菌株能夠捕食各種細菌。因此，我們推論出菌株EGB可能會影響土壤微生物。羣落結構分析表明，菌株EGB能動態改變土壤細菌的多樣性。共現網絡分析表明，菌株EGB推動了微生物羣落的改變。發現根部周圍微生物羣的高度連接降低了病原體的入侵成功率。觀察到潛在的有益植物的細菌(如芽孢桿菌，假單胞菌，固氮菌和溶菌桿菌) (Bacillus, Pseudomonas, Azotobacter, Lysobacter)與掠食性細菌之間存在顯著的正相關。珊瑚球菌和其他潛在有益細菌屬之間的正相關性可能有助於預防真菌感染，但需要進一步驗證。
EGB固體培養應用後真菌羣落的相互作用網絡變得更加脆弱。儘管尚不清楚土壤真菌多樣性的降低是否是抑制過程的指標，但許多研究表明，真菌多樣性和真菌羣落結構的複雜性與疾病抑制呈負相關。
已經詳細研究了BCAs的各種作用方式。然而，成功的生物防治不僅取決於植物與微生物的相互作用，還取決於BCAs的生態適應性。人工引入的PGPR的細胞密度在幾周內總是下降到一個較低的水平，而要實現生物防治功能，必須達到一個關鍵的定殖水平。但是，在低細胞密度下，BCAs很難積累足夠的抗生素來對抗病原體，佔據生態位或與土傳病原體競爭營養。除了BCAs菌株對植物病原體的直接影響外，現在還考慮了BCAs驅動的微生物羣落修飾對病原體發育的影響。我們認爲，通過捕食進行的生物防治爲土傳植物病原體的管理提供了巨大的機會。直接捕食植物病原體和競爭性土壤細菌對於BCAs在土壤環境中的適應性也是理想的。粘細菌是生長緩慢的細菌，具有產生耐熱孢子的能力，並且緩慢生長的耐熱細菌家族在植物保護中具有潛在作用。雖然如此，由於其廣泛的獵物範圍，EGB菌株對土壤微生物的非靶向作用應在未來研究中給予更多關注。
結論
根際微生物組在植物對土傳病原體抗性中的重要性已得到廣泛認可，而掠食性微生物在植物病原體的生物防治方面受到的關注較少。在田間試驗中，掠食性粘細菌珊瑚球菌(Corallococcus sp. )菌株EGB對枯萎病表現出強大的生物防治作用。我們的結果表明，菌株EGB通過捕食改變了土壤微生物羣落結構，*並減少了土壤中FOC的含量。考慮到EGB菌株的捕食習性及其對土壤環境的良好適應性，EGB菌株作爲一種新型的枯萎病生物防治藥劑具有巨大的商業開發潛力。
Reference
Xianfeng Ye,Zhoukun Li,Xue Luo,Wenhui Wang,Yongkai Li,Rui Li,Bo Zhang,Yan Qiao,Jie Zhou,Jiaqin Fan,Hui Wang,Yan Huang,Hui Cao,Zhongli Cui,Ruifu Zhang. A predatory myxobacterium controls
cucumber Fusarium wilt by regulating the soil microbial community.Microbiom, (2020) 8:49 https://doi.org/10.1186/s40168-020-00824-x
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