污水廠抗性組受細菌組成和基因交換驅動且出水中抗性表達活躍
原英文標題：Wastewater treatment plant resistomes are shaped by bacterial composition, genetic exchange, and upregulated expression in the effluent microbiomes
The ISME Journal, volume 13, pages346-360 (2019) [9.493]
DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-018-0277-8
作者名稱：Feng Ju 1,3, Karin Beck1, Xiaole Yin2, Andreas Maccagnana1, Christa S. McArdella1, Heinz Singer1, David R Johnson1, Tong Zhang2, Helmut Bürgmann1*
研究機構：
1 瑞士EAWAG研究所;
2 香港大學；
3 西湖大學（第一作者現單位）
撰稿人：袁凌，鞠峯；
校稿人：王慧；
單位：西湖大學環境微生物組與生物技術實驗室（EMBLab）
摘要
污水處理廠是向環境中傳播耐藥性的熱點。然而，目前對抗性基因在污水處理工藝過程中的消減、存留和演變的認識仍然不足。本文聯合使用了宏基因組和定量宏轉錄組的方法，提供了對污水中20種抗生素抗性基因（ARG）主型、65種殺菌劑抗性基因（BRG）主型和22種金屬抗性基因（MRG）主型歸趨和原位表達活性的廣譜定量分析。結果表明：在12個污水廠所有工段（進水、反硝化池、硝化池和出水）均能檢測到可持久存在且活躍表達的抗性基因；二沉池出水中各類抗性基因的表達活性相對更高，且可移動遺傳元件表徵基因（iMGEs）也具有更高的相對丰度和表達比率。此外，對於污水廠不同處理工段，所含有的抗性基因的豐富度（richness）和總丰度（abundance）差異很大，其相對丰度和絕對丰度與細菌羣落組成以及生物量濃度密切相關。儘管污水中殘留的亞致死濃度級別（102 - 103 ng/L）的抗生素與大環內酯或萬古黴素ARGs的基因丰度和表達活性具有顯著相關性，受測抗菌劑對抗性組組成方差解釋度較低。大規模的重疊羣分析既顯示抗性基因和可移動遺傳元件之間具有共線性關係，還表明存在着大規模人類病原體參與的抗性基因水平轉移。基於此，建議將ARGs的可移動率（M%）和宿主致病性（P%）作爲將來構建它們定量風險評分模型的重要參數，以最終評估環境抗性組在人類及家畜的疾病控制方面的生物學意義。
研究方法簡介
圖1 典型城鎮二級活性污泥污水處理廠示意圖
在瑞士的12個污水處理廠分別原位採集進水、反硝化池、硝化池、出水的微生物樣品並保存（圖1），記錄監測污水處理廠的常規水質參數和操作參數等環境參數，並測定多種抗菌類藥物及重金屬含量；提取並純化各樣品的總DNA和RNA，經高通量測序、質量控制、組裝、基因預測、功能註釋、定量宏組學指標計算（表S1）等一系列生物信息學流程對樣品進行抗性基因組的定性和定量分析。同時，在細胞裂解後，RNA提取前，通過加入已知拷貝數的mRNA內標物實現對樣本微生物組內所有轉錄本的絕對定量，計算方法如下：
Ta=(Ts×Pa)/Ps
Ta：某特定基因mRNA在樣本中的絕對拷貝數
Ts：某特定基因mRNA序列在樣品宏轉錄組中的數量
Pa：向樣品中加入mRNA內標物的絕對拷貝數
Ps：樣品宏轉錄組中回收到mRNA內標物序列的數量
表S1 定量宏基因組和宏轉錄組學指標及其定義和計算方式
主要結果和討論
(1) 抗性組的基因組成與抗性機制
所有宏基因組數據集中16554個DNA序列的開放閱讀框（簡稱“ORFs”）被預測爲ARG，7564個ORFs被預測爲BRG或MRG，且其中有7687個抗性基因ORFs與可移動遺傳元件表徵基因 (iMGEs，即包括轉座酶、轉座子、接合子、整合酶、整合子、重組酶、質粒等可移動元件的表徵基因) 具有共線關係（圖2a）。其中，抗生素抗性組編碼了多藥外排泵、胞外失活、抗生素靶點修飾等常見的抗性機制，檢出頻率最高的ARG主型包括多重耐藥、氨基糖苷類、β-內酰胺類、大環內酯類（圖2b）。
圖2 污水廠宏基因組數據中預測的抗生素、殺菌劑和金屬抗性基因
a.左座標軸對應折線圖，代表非冗餘ORFs中被註釋爲抗性基因的比例；右座標軸對應柱形圖，代表攜帶抗性基因contigs的數量。b. 編碼各類抗性基因的ORFs數量以及主要的抗性機理。
(2) 抗性組的基因和轉錄本歸趨
污水廠四個不同處理部位共享7.4( ± 4.1)%的非冗餘ARGs和2.6( ± 0.9)%的非冗餘ARG轉錄本，分別佔抗性組內所有基因和轉錄本平均相對丰度的26.1% （圖3a）和42.7%（圖3b），表明極少一部分在持續活躍的ARGs隨污水流動穿越污水廠。部分在進水中無法檢出的ARGs在下游處理部位被檢出，且不同部位還擁有各自特有的ARGs（圖3a）和ARGs轉錄本（圖3b），表明不同污水處理過程對抗生素抗性具有選擇效應。
圖3 污水廠進水、反硝化污泥、硝化污泥和出水抗性組基因和轉錄本的豐富度（richness）和豐度（abundance）
a-b污水處理廠的四個隔室中ARGs（a）及ARGs轉錄物（b）的豐富度（上層數字）和豐度（下層括號中數字）分佈。c-e 污水處理廠的四個隔室中ARGs、BRGs、MRGs、iMGEs根據每個16S基因對應的基因拷貝數GP16S（c）、每升樣本中的轉錄本拷貝數TPL（d）、每克生物量中的轉錄物數量TPB（e）、每個基因對應的轉錄本拷貝數TPG（f）來評估其丰度的箱線圖。P值：*<0.001 < <0.01 < * <0.05。
(3) 抗性組的基因表達活性
i) 硝化和反硝化污泥抗性轉錄本的總絕對丰度顯著高於進水和出水(圖3d)，這可能與前者細菌生物量遠高出後者1~2個數量級有關;
ii) 與之相反，硝化和反硝化污泥抗性基因和iMGEs轉錄本的總相對丰度顯著低於進水和出水(圖3e和3f)，說明後者具備更高的抗性基因和水平轉移表徵基因的表達活性；
iii）絕大部分抗生素、抗菌劑和金屬抗性基因主型的相對丰度(GP16S)及表達量(TPB和TPG)在出水中高於進水，說明傳統二級污水處理工藝既無法減少抗性基因相對水平，也無法消除其表達活性。
圖4 抗性基因主型及其轉錄本從進水到出水丰度的相對變化率
相對變化率（-1 ~ 1）定義爲出水和進水間的丰度差除以二者中的最大值；因此，正值和負值分別代表在經過污水處理廠處理之後被富集（紅色）或被削減（藍色）。P值：*<0.001 < <0.01 < * <0.05。a：頂端座標軸（柱狀圖）是TPB（即每克生物量中轉錄本拷貝數）的變化率，底端座標軸（灰色空心圓）是出水中各抗性基因主型的濃度。b：以TPG和GP16S爲單位的各抗性基因從進水到出水的相對變化量。結果表明：大部分的抗性基因主型的相對丰度及表達量在污水處理廠從進水到出水的過程中大量增加。
(4) 抗性組的生物與環境驅動因素
i) 抗性組基因及其轉錄本組成的冗餘分析表明：一類整合子整合酶intI1、接合蛋白酶編碼基因等生物因素對污水（出水和進水）抗性組方差解釋度大於受測環境因素（抗菌劑、水質參數、運行參數）；相反，受測環境因素對（硝化和反硝化）污泥抗性組方差解釋度大於生物因素。
ii) 該結果與抗性基因及可移動基因元件表徵基因在出水中的表達活性顯著高於活性污泥的結果一致（圖3e-3f），表明抗性基因水平轉移在前者中的強度可能強於後者。
iii) 作者推測由於二沉池出水中懸浮態細菌可能比活性污泥承受着更大的壓力脅迫（例如：前者中每克生物量比後者承受的抗生素和金屬負荷高），因而導致抗性基因在出水細菌中的選擇作用和表達活性顯著高於受污泥絮體保護的細胞。
iv) 在活性污泥絮體中抗菌劑抗性或解毒作用可通過胞外失活（如β-內酰胺和氨基糖苷類），胞外聚合物結合（如重金素和化學毒素）和生物降解或轉化（如可降解藥物）等間接方式實現。
v) 此外，通過從不同污水廠或處理部位回收的17,486個抗性重疊羣所得的比較基因組學分析，發現絕大部分多重疊羣（93.5%）共享了完全相同的抗性基因序列，表明存在抗性基因大規模交換的歷史。目前尚不明確這些轉移事件是否發生在污水處理廠。
(5) 污水亞致死濃度抗生素的抗性選擇
i) 關聯性分析表明污水中殘留的部分抗生素與ARGs（圖S9）及其轉錄本（參考原文圖S10）顯著強關。
ii) 一方面，污水環境中殘留的克拉黴素 (76-460 ng/L) 和阿奇黴素 (46-310 ng/L)的濃度與大環內酯類抗性基因 macB的基因丰度（圖S9a-c）以及轉錄本丰度呈顯著強相關，表明的污水中殘存的亞致死濃度的抗菌劑既可能選擇抗生素抗性，又可誘導抗性基因表達。
iii) 另一方面，污水中殘留的大環內酯類抗生素濃度與萬古黴素抗性基因（圖S9d-e）以及轉錄本丰度具有強相關性；大環內酯類ARGs和萬古黴素ARGs的總丰度強相關，且在組裝回收的抗性重疊羣上具有良好的共線關係；表明污水環境中特定抗生素可促進其他類型抗生素抗性基因的共選擇和誘導表達。
圖S9 污水處理廠各處理部位抗生素和抗性基因的正相關性
(6) 抗性基因的可移動性和宿主致病性：
i) 爲了量化抗性基因在環境中發生水平基因轉移的潛力，本文首次提出了抗性基因的可移動率(M%)的概念和計算方法：M% = N1/N2×100%；其中，N1代表與可移動遺傳元件表徵基因共線的抗性重疊羣的數量; N2代表編碼抗性重疊羣的數量;
ii) 假定M%越大，抗性基因的可移動性率越高，在細菌間傳播風險更大；M%越小，抗性基因的可移動率越低，傳播風險更小;
iii) 在抗性組水平預測出污水廠內ARGs，BRGs和MRGs的平均可移動率分別爲8.6%，11%和20%; 其中，β-內酰抗性基因（CTX-M-14, OXA-58,OXA-181，TEM等），大環內酯類抗性基因（ermB 和 mel），磺胺類抗性基因（sul1, sul2和 sul3) 以及銅（ctpG）、汞（merE, merT等）和銀(silP）等抗性基因都顯示出高可移動性率（M%>95%）。關於所有抗性基因可移動率信息請參考原文表S5和S6）。
(7) 抗性組與細菌羣落的強關聯性
本研究通過宏基因組、定量宏轉錄組以及環境數據分析表明：基因交換是污水廠抗性組的重要驅動因素之一。若水平基因轉移促使相同的抗性基因序列大規模在遠緣物種間傳播，那麼細菌羣落組成和抗性組成的相關性會較弱。然而，普氏分析結果表明：抗性基因組成與細菌羣落組成（基於16S的OTUs分析）呈顯著強相關性，表明抗性基因在不同細菌間的傳播存在一定的物種系統發育和親緣關係的界限。
圖5 污水廠不同處理部位抗性基因組的組成與細菌羣落組成相關。
a-c NMDS分析描述了不同部位之間基於ARG（a）、BRG（b）、MRG（c）組成的Bary-curtis距離。d-f 普式分析表明細菌羣落組成（Bray-Curtis，紅點）和ARG（d）、BRG（e）、MRG（f）組成呈顯著強相關性。
(8) 抗性組的風險評價和管理啓示
定量風險評估：利用抗性基因的可移動率（M%），本研究能夠在“抗性亞型”、“抗性主型”以及“生態系統”三個水平預測和比較發生抗性基因水平傳播的潛能。這是未來抗性基因風險分級的一個重要方面（Martínez et al 2015）。本研究從污水廠出水中鑑定出可移動率高達100%的典型ARGs包括CTX-M、OXA和TEM家族廣譜β-內酰胺酶（ESBL）和OXA家族碳青黴烯酶類等重要醫用抗生素的抗性基因。除了基因流動性外，抗性基因的風險評級還應考慮抗性基因宿主致病性，以及抗性類型在人類和/或家畜疾病控制方面的臨牀重要性。本研究從污水廠發現 11 個非冗餘 ARGs (總共代表 138個ORFs序列)，其序列組成與人類臨牀分離物病原體基因組或質粒攜帶的ARGs序列信息完全一致（表3）；這些“致病性”ARGs（例如，sul1、ermB、ANT3和cmlA）在污水廠二沉池出水中基因（11/12）和轉錄本（9/12）檢出比例都很高。因此，還需要進一步考察它們在受納環境中的歸趨和潛在健康風險。
表3：獲得與已知人類致病菌攜帶ARGs序列完全相同的抗性基因
排放總量控制：除非充分證實污水廠出水對人類健康的直接風險，否則目前還不需要對污水廠抗生素耐藥性決定因素進行預防性或控制性的措施。然而，我們的數據表明：污水廠排放到環境中的抗藥性細菌和基因的絕對數量在很大程度上取決於出水中殘留的細菌絕對生物量。因此，任何大幅度減少排放污水中細菌生物量的措施，如適當延長二沉池的水力停留時間或膜過濾工藝處理，都將減少未來污水廠抗性基因此類新型環境污染物的排放總量。與此觀點一致，之前研究的實驗數據證實（Munir et al 2011）：基於膜生物反應器工藝的污水廠對於特定ARGs和抗性菌絕對量的去除效率顯著高於傳統活性污泥工藝污水廠。
責編：劉永鑫 中科院遺傳發育所
Reference
1 Feng Ju, Karin Beck, Xiaole Yin, Andreas Maccagnan, Christa S. McArdell, Heinz P. Singer, David R. Johnson, Tong Zhang & Helmut Bürgmann. Wastewater treatment plant resistomes are shaped by bacterial composition, genetic exchange, and upregulated expression in the effluent microbiomes. The ISME Journal 13, 346-360, doi:10.1038/s41396-018-0277-8 (2019).
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