本文選自2021年的nature，喜歡的可以自行下載閱讀，這個難度你感受一下
摘要：鐵死亡是一種鐵依賴的非凋亡細胞死亡過程，與各種退行性疾病有關，並代表某些癌症的靶向易感性。易患鐵死亡的細胞狀態可以預先存在於由某些譜系產生的細胞中，也可以在細胞狀態轉變過程中獲得。然而，對鐵死亡的敏感性是如何被動態調節的仍然知之甚少。在這裏，我們使用全基因組CRISPR-Cas9抑制劑篩選來鑑定過氧化物酶體氧化細胞器，作爲人類腎和卵巢癌細胞鐵死亡敏感性的關鍵因素。利用脂質組學圖譜，我們表明過氧化物酶體通過合成多不飽和醚磷脂(PUFA-ePLS)促進鐵死亡，多不飽和醚磷脂作爲脂質過氧化的底物，反過來導致鐵死亡的誘導。在小鼠體內，最初對鐵死亡敏感的癌細胞可以轉變爲抗鐵死亡狀態，這與PUFA-ePLS的廣泛下調有關。我們進一步發現，PUFA-ePLS的促鐵死亡作用可以擴展到腫瘤細胞以外的其他細胞類型，包括神經元和心肌細胞。總之，我們的工作揭示了過氧化物酶體-醚-磷脂軸在驅動鐵死亡易感性和逃避鐵死亡中的作用，強調了PUFA-ePLS是一種獨特的功能性脂質類，在細胞狀態轉變過程中受到動態調節，並建議對涉及鐵死亡的疾病進行治療干預的多個調節節點。
鐵死亡敏感性動態調節的分子和代謝基礎知之甚少。爲了確定調節鐵死亡易感性的因素，我們在鐵死亡易感性透明細胞腎細胞癌(ccRCC)模型786-O3和高級漿液性卵巢癌模型OVCAR-8中進行了兩個獨立的全基因組CRISPR-Cas9抑制篩選(圖1a)。在這兩種模型中，通過使用ML210或1S，3R-RSL3抑制脂質過氧化修復酶谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)來誘導鐵死亡(補充視頻1)。兩個篩選都揭示了已知的鐵死亡調節因子——包括酰基輔酶a合成酶長鏈家族成員4(ACSL4)8(圖1b，擴展數據圖1a，b，補充數據1)——證實了我們的篩選在識別鐵死亡敏感性介質方面的穩健性。在以前未被特徵化的親鐵基因中，過氧化物酶體成分作爲最豐富的基因簇出現，使用了STRING(蛋白質網絡數據庫9)和我們開發的路徑分析算法，命名爲基因列表網絡富集分析(GeLiNEA)(擴展數據圖1a-e，補充數據2)。在兩個篩選中鑑定的過氧化物酶體基因包括過氧化物酶體生物發生基因PEX10和PEX3，以及編碼過氧化物酶體酶體烷基甘油酮磷酸合酶(AGPS)和脂肪酰基輔酶a還原酶1(FAR1)12的基因；其他過氧化物酶體基因——包括甘油磷酸酰基轉移酶(GNPAT)、PEX12和PEX7——在每個單獨的時間點都顯著富集(圖1b，擴展數據圖1a，b，f，g)。
因爲過氧化物酶體以前並未涉及鐵死亡，我們着重闡明瞭它們在這一過程中的可能作用。我們發現使用CRISPR-Cas9在OVCAR-8和786-O細胞中消除編碼PEX3、PEX10和PEX12的基因降低了過氧化物酶體的丰度，並降低了細胞對GPX4抑制誘導的鐵死亡的敏感性(圖1c，擴展數據圖2a-d)。相反，小鼠Pex3或Pex10cDNAs的實驗性過表達對相應的人單導向RNAs(sgRNAs)的失活具有抗性，恢復了對鐵死亡的敏感性(擴展數據圖2e，f)，支持過氧化物酶體作爲腎和卵巢癌細胞鐵死亡易感性的貢獻者的作用。
在其他生化功能中，過氧化物酶體對細胞溶質活性氧進行解毒，並啓動超長鏈和支鏈脂肪酸的降解。此外，過氧化物酶體參與醚連接的甘油酯的生物合成，與酯連接的二酰基甘油酯(R1CH2CO2CH2R2)不同，其在甘油sn-1位置具有醚鍵(圖2a，擴展數據圖3a)。醚磷脂包括兩個亞型:1-O-烷基-甘油磷脂(r1ch2ch 2 och 2r2)；和1-O-烯基-甘油磷脂(R1CH=CHOCH2R2)，稱爲縮醛磷脂。大多數縮醛磷脂在sn-2位置具有酯連接的多不飽和脂肪酰基(PUFA)鏈(圖2a)。與過氧化物酶體的脂質合成功能一致，脂質組學圖譜顯示在PEX3-和PEX10-耗盡細胞中均有選擇性的醚甘油脂類損失；這種減少對於多不飽和醚磷脂(PUFA-ePLS)來說最爲顯著，多不飽和醚磷脂可能主要是縮醛磷脂(圖2b，擴展數據圖3b，補充數據3，4)。（換言之就是過氧化物酶體參與縮醛磷脂的合成，並且縮醛磷脂主要就是多不飽和醚磷脂）
因爲AGPS和FAR 1——催化醚類脂生物合成的兩種過氧化物酶體相關酶——也在CRISPR篩選中名列前茅，我們提出醚類脂生物合成可能是過氧化物酶體的促鐵死亡作用的組成部分。事實上，CRISPR-Cas9介導的AGPS基因或FAR1基因的缺失，無論是在羣體中還是在衍生的單細胞克隆中，都概括了鐵死亡抗性表型和過氧化物酶體缺失時觀察到的醚磷脂的伴隨變化(圖2c-g，擴展數據圖3c-m，4a-e，補充數據3，4)。CRISPR-Cas9敲除程序的特異性通過將抗sgRNA的Agps或Far1cDNAs引入這些細胞來逆轉這些表型來驗證(擴展數據圖5a-c)。
通過野生型細胞中異位cDNAs的過度表達、短髮夾RNA(shRNA)介導的基因敲除和AGPS13小分子抑制劑的使用(擴展數據圖5d-h)，進一步證實了乙醚脂質生物合成途徑的促鐵作用。相比之下，剔除與乙醚脂質代謝無關的兩種過氧化物酶體——超氧化物歧化酶1(由SOD1編碼)和過氧化氫酶(由CAT編碼)——並沒有改變細胞對鐵死亡的敏感性(擴展數據圖5i–k)，這與過氧化物酶體的促鐵死亡作用是由乙醚脂質生物合成特異性介導的一致。值得注意的是，過氧化物酶體或醚脂質的減少也降低了GPX4依賴性HhH-7肝細胞癌和SNU-685子宮內膜癌細胞對鐵死亡的敏感性(擴展數據圖6a-e)。此外，對以前脂質組學數據的分析顯示，與正常腎組織相比，ccRCC腫瘤(一種已知易受鐵敏感3的癌症類型)表現出更高水平的多不飽和脂肪和增加的AGPS表達(擴展數據圖6f)。這些分析表明，乙醚脂質生物合成途徑的促鐵死亡作用可能適用於其他癌細胞類型和人類癌症。
值得注意的是，在過氧化物酶體減少的細胞中，醚磷脂的損失發生在ACSL4或溶血磷脂酰膽鹼酰基轉移酶3(LPCAT3)——大多數細胞多不飽和脂質生物合成中的限速酶——水平沒有顯著變化的情況下(擴展數據圖7a，b)。ACSL4與過氧化物酶體和醚脂質生物合成基因的共同缺失導致了對鐵死亡的進一步保護——類似於鐵死亡抑制劑鐵抑制素-1(Fer-1)所賦予的效果(擴展數據圖7c，d)。這些觀察表明非過氧化物酶體衍生的PUFA脂質參與了鐵死亡，並指出一種潛在的組合策略，該策略包括抑制ACSL4和PUFA-ePL生物合成酶來阻斷鐵死亡。
乙醚脂質生物合成是通過過氧化物酶體與內質網(ER)的功能協作實現的。在過氧化物酶體中，酶FAR1、GNPAT和AGPS作用於合成醚類脂前體1-O-烷基-甘油-3-磷酸(AGP)。然後AGP被送到內質網，在那裏它在甘油的sn-2位被酰化，頭基被加到sn-3位，在縮醛磷脂的情況下，通過脫氫形成雙鍵，形成鏈烯基醚連接。雖然sn-2位的PUFA加成對於鐵死亡相關的醚類脂的合成至關重要，但尚不清楚是哪種內質網酶介導了這一過程。我們在兩個CRISPR screening(圖1b，擴展數據圖1a，b，f，g)中發現ER-駐留酶1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基轉移酶3(由AGPAT3編碼)。AGPAT3在人類單倍體KBM7細胞的CRISPR篩選中也是促鐵死亡的。值得注意的是，據報道AGPAT3選擇性地將花生四烯酸或二十二碳六烯酸結合到溶血磷脂酸中，導致二酰基PUFA-磷脂酸的合成。然而，AGPAT3是否也有助於AGP酰化和PUFA-ePL生物合成尚不清楚。（介紹了一下脂質代謝相關內容，真是搞基礎必須基礎好纔行）
爲此，我們進行了脂質組學分析，顯示AGPAT3的耗盡選擇性地降低了醚連接和二酰基磷脂中多不飽和物質的水平(圖2h，擴展數據圖7e，補充數據3，5)。與上述一致，AGPAT3的基因缺失抑制了對鐵死亡的敏感性(圖2i，擴展數據圖7f–j)，證實了AGPAT3的促鐵死亡作用。此外，CRISPR抗性的野生型Agpat3基因的表達在AGPAT3缺失的細胞中恢復了鐵死亡敏感性，而催化死亡的Agpat3E176A變異體未能做到這一點(擴展數據圖7k，l)。這些結果表明AGPAT3在過氧化物酶體途徑的下游起作用，在內質網中合成PUFA-ePLs(擴展數據圖8a)。
爲了證實PUFA-ePLs是必需的，並足以誘導對鐵死亡的敏感性，我們將各種二酰基和醚磷脂配製成脂質體納米顆粒，用於遞送至細胞(擴展數據圖8b)。在含乙醇胺的磷脂中，應用C18(漿)-C20:4PE、C18(漿)-C22:6PE或C18:0-C20:4PE-但不應用C18(漿)-C18:1PE-導致OVCAR-8細胞中的鐵死亡敏化(其中(漿)表示鏈烯基-甘油磷脂；擴展數據圖8c)。在含膽鹼的磷脂中，C18(血漿)-C20:4PC——但不是C18(血漿)-C18:1PC——顯示出顯著的鐵死亡敏化活性，而C18:0-C20:4PC、C18(血漿)-C22:6PC和C16(-O-)-C20:4PC顯示出中間效應(擴展數據圖8d，e)。在PEX3-、PEX10-或AGPS貧化OVCAR-8和786-O細胞中觀察到類似的效果(擴展數據圖8c，d)。這些結果表明，PUFA鏈的存在——而不是烯基醚基團——對鐵死亡敏化是至關重要的。
爲了排除攝取後應用的PUFA-ePL細胞內轉化爲其他磷脂的可能性，我們使用脂質納米粒給藥後立即在GPX4抑制的細胞中進行BODIPY-C11氧化的延時成像來評估脂質過氧化水平。該分析顯示，C18:0-C20:4PE和C18(血漿)-C20:4PE均在添加後10分鐘內誘導脂質過氧化迅速增加，而C18(血漿)-C20:4PC誘導的過氧化水平略高於C18:0-C20:4PC(擴展數據圖9a-e)。這些數據表明PUFA縮醛磷脂在GPX4抑制的細胞中確實被氧化了。PUFA-ePE和PUFA-ePC (ePE，醚連接磷脂酰乙醇胺；用ML210處理的細胞中的ePC(醚連接的磷脂酰膽鹼)水平，即使處理時間短至90分鐘，這種處理使細胞處於存活狀態，即使它們經歷由脂質過氧化誘導的磷脂水解增加(擴展數據圖9f，補充數據6)。
我們接下來評估過氧化物酶體是否也促進體內對鐵缺乏的敏感性。由於缺乏適用於體內使用的GPX4抑制劑，我們產生了GPX 4/-OVCAR-8和786-O細胞，它們依賴鐵死亡抑制劑Fer-1來維持其活性。與表達非靶向陰性對照sgRNAs(sgNC)的GPX4/-細胞相反，在沒有Fer-1的情況下，GPX4/-細胞經歷了快速的鐵死亡，同時也耗盡PEX3、PEX10、AGPS或FAR1，顯示出體外生存力增加(圖3a，擴展數據圖10a)。當植入免疫缺陷小鼠體內時，GPX4+/+細胞迅速形成腫瘤，而GPX4/-SGNC細胞的腫瘤形成明顯延遲，表面上是因爲這些細胞在體內經歷了鐵死亡；然而，伴隨GPX4和AGPS、FAR1、PEX3或PEX10缺失的細胞在第6周形成了比GPX4/-SGNC細胞更大的腫瘤(圖3b)。這些結果表明，過氧化物酶體-醚-脂質軸在體外和體內都有助於鐵死亡敏感性。值得注意的是，我們的數據表明，AGPS-、FAR1-、PEX3-或AGPAT3-缺失的癌細胞可以在體外和體內健壯生長(圖3a，b，擴展數據圖10b–e)。這些結果表明，醚磷脂對原發性腎癌和卵巢癌的生長是不可缺少的，儘管它們的富集易導致鐵死亡。
我們還研究了癌細胞是否能夠進化出策略來逃避實驗誘導的鐵死亡。我們觀察到，在OVCAR-8和786-O腫瘤異種移植物中，易發生鐵死亡的GPX4細胞最初似乎不能在小鼠體內定居；然而，在潛伏期後出現大的腫瘤結節(圖3b，c)。我們成功地從出現的786-O腫瘤中分離出癌細胞，並證實這些細胞保持GPX4-/-(圖3d)。將這些明顯抗鐵死亡(FR1)細胞重新植入小鼠體內，導致腫瘤生長健壯，沒有明顯的潛伏期(圖3e)，這意味着FR1細胞獲得了一種或多種細胞遺傳特性，使其對GPX4缺失不敏感。
爲了探索體內觀察到的逃避鐵死亡的機制，我們對從GPX4-/-FR1細胞(稱爲FR2細胞)形成的腫瘤中分離的細胞進行了代謝組學和脂質組學分析。我們發現，相對於從親代、鐵死亡易感性腫瘤製備的細胞中的水平，PUFA-ePLs在FR2細胞中是最顯著下調的脂質(圖3f-h，擴展數據圖10f-h，補充數據7)。這些結果表明，ccRCC細胞可以調節其PUFA-ePL水平，這種生化可塑性可能有助於體內鐵死亡的逃避。（鐵死亡並不一定只是起到抗腫瘤作用，腫瘤細胞可以通過代謝的調節從而適應這種脂質過氧化損傷進而促進腫瘤生長，換言之，就是遺傳性鐵死亡易感性可以通過代謝的調節從而產生鐵死亡抵抗）。
我們接下來評估了在ccRCC細胞中觀察到的PUFA-ePLs的下調是否可能是由有缺陷的過氧化物酶體生物發生驅動的。與來自親代腫瘤的細胞相比，我們在FR2細胞中沒有發現過氧化物酶體丰度的重大變化(擴展數據圖10i)。
此外，外顯子組測序僅揭示了FR2細胞中的一個非同義體細胞突變:TLR7的一個小的移碼缺失，這在我們的CRISPR篩選中沒有發現，也沒有報道與鐵死亡相關的功能(補充數據8)。然而，RNA測序顯示，在87個已知的過氧化物酶體和醚脂質生物合成基因中，AGPS和TMEM189(也稱爲PEDS1)在FR2細胞中顯著下調——這種降低在蛋白質水平上得到驗證(圖3i，j，擴展數據圖10j，k，補充數據8)。其他已知的鐵死亡調節基因——包括ACSL4、LPCAT3和AIFM2(編碼FSP1)22、23——的表達水平沒有顯著改變(擴展數據圖10k，l)。（既然認爲GPX4和AGPS/TMEM189具有相關性，那如何GPX4通過什麼改變了這兩個基因的表達呢？）
TMEM189編碼1-O-烷基-PE去飽和酶，該酶將1-O-烷基醚轉化爲1-O-烯基醚，並在癌症依賴性圖譜中顯示與ACSL4、PEX3和FAR1的共依賴性(擴展數據圖11a)。然而，TMEM189在我們的CRISPR screen上並沒有獲得顯著的hit。此外，使用CRISPR-Cas9、shRNA或cDNA干擾TMEM189水平並未顯著改變受試細胞系對鐵死亡的敏感性(擴展數據圖11b-g)，這意味着PUFA-ePLs的促鐵死亡作用與烯基-醚鍵中存在的雙鍵無關。相比之下，我們發現AGPS失活(消耗1-O-烷基脂質和1-O-烯基脂質)足以恢復GPX4腫瘤的生長。這表明AGPS的自發下調——而不是TMEM189——導致了在ccRCC模型中觀察到的鐵死亡抗性的出現。
然後我們探討了PUFA-ePLs的鐵死亡作用是否與非腫瘤環境相關。我們選擇將神經元和心肌細胞分別視爲大腦和心臟的主要細胞類型——表現出高ePL水平的重要器官，據報道在某些病理條件下會發生鐵死亡。在SH-SY5Y神經元分化模型中，我們發現分化的神經元比親代細胞對GPX4抑制誘導的脂質過氧化和鐵死亡表現出更高的敏感性，這種差異與神經元中上調的PUFA-ePEs和PUFA-ePCs有關(圖4a-c，擴展數據圖12a-e，補充數據9)。
我們還發現來源於人類誘導多能幹細胞(iPS細胞)的心肌細胞比來源於iPS細胞的心臟祖細胞對GPX4抑制更敏感(圖4d，擴展數據圖12f，g，補充視頻2)。在用ML210治療的心肌細胞中觀察到具有鐵死亡樣形態的細胞死亡，並且通過與liproxstatin-1或Fer-1共同治療來防止細胞死亡，但是沒有通過與壞死抑制因子壞死抑制因子-1或凋亡抑制因子z-VAD-FMK共同治療來防止細胞死亡(擴展數據圖12h，I，補充視頻3)。
我們的脂質組學分析進一步揭示，與心臟祖細胞相比，心肌細胞顯著上調PUFA-ePCs和PUFA-ePEs(圖4e，擴展數據圖12j，補充數據10)。此外，敲除PEX3或AGPS降低了心肌細胞對鐵死亡的敏感性(圖4f，擴展數據圖12k)，表明PUFA-ePLs上調有助於提高心肌細胞的鐵死亡敏感性。總之，PUFA-ePLs的選擇性上調與神經元和心臟譜系的鐵死亡易感性狀態相關(圖4g)。
我們在這裏描述了過氧化物酶體和PUFA-ePLs在調節癌症以及神經元和心臟疾病中鐵死亡易感性中的重要性。此外，通過下調ePL生物合成酶的表達來促進低PUFA-ePL狀態的獲得，可導致攜帶ccRCC的宿主逃避鐵缺乏症和腫瘤復發。儘管縮醛磷脂——主要的PUFA-環氧丙烷類型——由於其烯基醚基團的反應性而被視爲抗氧化劑，但我們的研究描述了一種額外的親鐵死亡作用，這種作用對在sn-2位具有PUFA的環氧丙烷是特異性的。鑑於已發現阿爾茨海默病患者的屍檢腦樣本表現出顯著降低的縮醛磷脂水平，有必要進一步研究縮醛磷脂介導的鐵死亡在神經退行性變中的作用。我們還注意到，據報道，心肌細胞的鐵死亡會導致化療和缺血再灌注誘導的心肌疾病，並且鐵螯合劑右丙氧烷是食品藥品監督管理局批准的治療阿黴素誘導的心臟毒性的唯一藥物。這些不同的發現表明，鐵死亡的誘導可能是一種強有力的抗癌策略，阻斷鐵死亡過程可能有助於預防或減輕對大腦和心臟的各種損傷。