本文選自molecular cell biology
摘要：自2012年該術語被創造出來以來，在過去的幾年裏，鐵死亡的研究領域經歷了指數級的增長。這種由鐵依賴性磷脂過氧化作用驅動的獨特的細胞死亡方式受多種細胞代謝途徑的調節，包括氧化還原穩態、鐵代謝、線粒體活性和氨基酸、脂質和糖的代謝，以及與疾病相關的各種信號通路。許多器官損傷和退行性病變是由鐵死亡引起的。有趣的是，對治療有抵抗力的癌細胞，尤其是那些處於間質狀態並易於轉移的細胞，非常容易出現鐵死亡。因此，通過誘導和抑制對鐵死亡進行藥理學調節，在治療耐藥性癌症、缺血性器官損傷和與廣泛脂質過氧化相關的其他退行性疾病方面具有巨大潛力。在這篇綜述中，我們提供了對目前鐵死亡的分子機制和調節網絡、鐵死亡在腫瘤抑制和免疫監測中的潛在生理功能、其病理作用以及治療靶向的潛力的批判性分析。重要的是，在所有快速發展的研究領域，由於誤解和不適當的實驗方法，挑戰是存在的。本綜述還旨在解決這些問題，併爲提高鐵死亡研究的可重複性和可靠性提供實用指南。最後，我們討論了重要的概念和迫切的問題，應該是未來鐵死亡研究的重點。
細胞代表生命的基本組織單位。因此，細胞增殖、分化和功能特徵，以及最終的細胞死亡在生命的無數表現中至關重要。細胞的命運和功能受到環境和遺傳因素的影響。決定細胞命運的最關鍵的軸之一是細胞如何對氧化應激反應，因爲大多數生物在基於還原/氧化(氧化還原)的代謝過程中依賴氧作爲最終的電子受體。在導致細胞氧化應激的因素中，膜雙層中脂質的氧化修飾——特別是脂質過氧化——已成爲細胞命運的重要調節因素，廣泛的脂質過氧化通過一種稱爲鐵死亡的獨特細胞死亡模式使細胞死亡。現在，鐵死亡被認爲可能是最廣泛和最古老的細胞死亡形式之一:雖然最初是在哺乳動物系統中研究的，但鐵死亡樣細胞死亡也在進化上遙遠的物種中觀察到，例如那些屬於植物、原生動物和真菌的物種。值得注意的是，脂質過氧化整合了一系列環境和遺傳背景，包括熱和輻射暴露、代謝、氧化還原穩態和細胞間接觸，以及致癌和腫瘤抑制信號。根據對鐵死亡的誘導，越來越多的證據表明鐵死亡在腫瘤抑制和免疫中的潛在生理作用(圖1)。最近，鐵死亡還與某些真菌物種的正常發育和線蟲的發育老化有關。此外，鐵死亡的病理生理學相關性，特別是作爲癌症治療和預防缺血性器官損傷的治療模式，已經令人信服地建立。
雖然鐵死亡這個術語是最近才被提出來的，但在2012年，鐵死亡的一些方面或特殊形式很久以前就被觀察到了——例如，在20世紀中期的代謝研究中，一種氧化應激誘導的神經元細胞死亡被稱爲“氧化病”。哈里·伊格爾在20世紀50年代和60年代進行的關於我們現在所理解的鐵死亡的開創性工作表明，氨基酸半胱氨酸的缺失會導致細胞死亡，半胱氨酸的內源性合成使細胞對這種細胞死亡具有抗性。現在，我們意識到半胱氨酸是還原型谷胱甘肽的生物合成是限速的。
谷胱甘肽是哺乳動物細胞中最豐富的還原劑，對鐵硫簇的生物生成很重要，並且是多種酶的輔因子，包括谷胱甘肽過氧化物酶(GPXs)和谷胱甘肽硫轉移酶。對於谷胱甘肽的合成，半胱氨酸可以通過中性氨基酸轉運蛋白從環境中吸收，也可以通過xc-胱氨酸/穀氨酸鹽反轉運蛋白系統(一種包含亞單位SLC7A11和SLC3A2的跨膜蛋白複合物)以氧化形式(胱氨酸)吸收。在本文中被稱爲系統xc)-或在反式硫化途徑中使用甲硫氨酸和葡萄糖合成。已經從遺傳學上證明，維持谷胱甘肽合成或促進系統xc-或谷胱甘肽過氧化物酶4 (GPX4)的活性可以保護細胞免受各種氧化應激條件引發的死亡，特別是那些導致硫醇剝奪的條件，將這些早期研究與鐵死亡的機制聯繫起來。
從歷史上看，細胞死亡被認爲是被動的和不受調節的——直到20世紀70年代發現凋亡是編程性細胞死亡的第一種形式，因爲它是由發育編程的途徑執行的。調節性細胞死亡的更廣泛類別指的是分子調節的死亡程序，但不一定是發育程序。我們現在知道，鐵死亡符合這一受調節的細胞死亡標準:它是由致命的脂質過氧化作用驅動的——這是細胞代謝和不平衡的氧化還原穩態的結果——並且可以通過直接阻斷脂質過氧化作用或通過藥物或遺傳手段消耗鐵來抑制（鐵死亡是一種RCD）。
儘管如此，在許多方面，鐵死亡的領域仍然是新生的，在過去的幾年裏，它只是從氨基酸和脂類代謝、鐵穩態、氧化還原和硒生物學以及細胞死亡等鄰近領域中融合而來。已發表的關於鐵死亡的研究數量呈指數級增長，因此有必要對最近的進展進行徹底和批判性的審視，以便爲不同的研究人員羣體明確圍繞這一主題的關鍵發現、問題和挑戰。在此，我們提供了對鐵死亡的機制和調節、其潛在的生理功能及其在疾病和治療中的作用的深入分析。我們討論對該領域具有重要概念的新問題和挑戰。我們還提供了實用的實驗建議，以指導鐵死亡的研究。
Mechanisms governing ferroptosis
近年來，在對鐵死亡的機理理解方面取得了快速進展。通過系統xc–GSH–GPX4途徑在抑制鐵死亡中的作用的初步發現，磷脂氫過氧化物(一種基於脂質的活性氧(ROS)形式)作爲鐵死亡的執行者的作用現已確立(圖2)。最近，已經確定了GPX4非依賴性鐵死亡監測途徑。此外，多不飽和脂肪酸合成的機制——特別是多不飽和脂肪酸(多不飽和脂肪酸的前體)的合成和活化——已經在鐵死亡的背景下進行了廣泛的研究。重要的是，所有這些研究都集中在細胞代謝上，並揭示了鐵死亡和代謝途徑之間的密切關係（鐵死亡與代謝爲起始階段）。
The key role of GPX4
爲了發現新的小分子抗癌療法，Stockwell 小組從2001年開始進行高通量篩選，並於2003年公佈了一系列能夠誘導一種獨特形式的非凋亡、非壞死性細胞死亡的化合物。反篩選顯示多種鐵螯合劑和親脂性自由基捕獲抗氧化劑抑制這種類型的細胞死亡。在這種細胞死亡模式中對鐵的需求激發了術語“鐵死亡”的誕生。隨後的機制研究確定了兩種細胞成分，系統xc–和GPX4，它們分別被化合物erastin和RSL3抑制，從而導致鐵死亡。 GPX4，一種最初由Ursini和他的同事通過生化純化發現的硒蛋白，是催化哺乳動物細胞中PLOOHs還原(從而解毒)的主要酶。GPX4將磷脂和膽固醇氫過氧化物還原成相應的醇需要GPX4的催化硒代半胱氨酸殘基和兩個電子，通常由GSH提供，但有時也由其他低分子硫醇，甚至蛋白質硫醇提供。康拉德小組對第一個條件性Gpx4敲除小鼠模型的徹底研究提供了早期證據——在鐵死亡被認爲是一種獨特的細胞死亡方式之前——表明Gpx4的缺失導致小鼠胚胎成纖維細胞脂質過氧化依賴的非凋亡細胞死亡，以及海馬和大腦皮質區域的神經退化。這種和其他幾種小鼠模型有助於描繪鐵死亡體內相關性的更詳細的圖像，如下文進一步討論的。
由於GPX4是主要的PLOOH中和酶，erastin/RSL3誘導的鐵死亡的一般機制出現了:兩種化合物都直接滅活GPX4-RSL3，erastin通過抑制胱氨酸的輸入間接滅活GPX4-RSL3，從而剝奪細胞中的半胱氨酸，半胱氨酸是谷胱甘肽的重要細胞組成部分。因此，PLOOHs 積累，可能導致快速和不可修復的膜損傷，導致細胞死亡(圖2a)。從概念上講，這些發現確立了鐵死亡是一種細胞死亡方式，其機制不同於其他已知的死亡過程。
Drivers of phospholipid peroxidation
無限制的脂質過氧化是鐵死亡的標誌。20世紀50年代的早期研究指出了微量元素硒以及維生素E和半胱氨酸對脂質過氧化的抑制作用。脂質過氧化反應的啓動需要從結合到脂質雙層中的磷脂(PUFA-PLs)中的多不飽和脂肪酰基部分，去除雙烯丙基氫原子(位於兩個碳-碳雙鍵之間)。這導致形成以碳爲中心的磷脂自由基，隨後與分子氧反應生成磷脂過氧自由基，從另一個PUFA中除去氫，形成磷脂過氧自由基(圖3)。如果未被GPX4轉化爲相應的醇(PLOH)，PLOO和脂質自由基——特別是PLOO和烷氧基磷脂自由基(PLO)——將與PUFA-PLs反應，通過進一步除去氫原子、與分子氧反應和形成PLOOH來促進PLOOH的產生。最終，這將導致次級產物的形成，包括脂質過氧化物(如4-羥基壬烯醛和丙二酸二酯)的分解產物以及氧化和修飾的蛋白質。這種連鎖反應可能最終導致膜完整性的破壞，並最終導致細胞器和/或細胞膜的破裂。因此，含有高PUFA-PL含量的膜特別容易受到過氧化作用的影響，這在神經元中已有證明。與鐵死亡過程中發生的脂質過氧化作用相關的精確細胞膜，如線粒體、內質網、過氧化物酶體、溶酶體和質膜中的膜，目前尚不清楚。
基於全基因組單倍體和CRISPR-Cas9的篩選揭示了兩種膜重塑酶，酰基輔酶a合成酶長鏈家族成員4(ACSL4)和溶血磷脂酰膽鹼酰基轉移酶3(LPCAT3)，是鐵死亡的重要驅動因素。ACSL4在鐵代謝過程中的作用是基於其將長鏈多不飽和脂肪酸(包括花生四烯酸(20:4)和腎上腺酸(22:4))與輔酶a連接的能力。然後這些產物可以通過各種脂多糖酶重新酯化成磷脂，從而增加長鏈多不飽和脂肪酸在細胞中向脂質和膜中的結合。ACSL4的遺傳缺失或其藥理學抑制導致磷脂中長鏈PUFA尾顯著轉變爲短鏈和單不飽和脂肪酰基(MUFA)尾。ACSL4缺陷細胞的磷脂膜的這種變化使得它們在Gpx4敲除後能夠增殖數月，從而將這些細胞從鐵死亡中拯救出來。據報道，外源性補充多不飽和脂肪酸、硬脂酰輔酶a去飽和酶1(SCD1)介導的細胞MUFA產物和ACSL3依賴性膜多不飽和脂肪酸富集可降低細胞鐵死亡的傾向。值得注意的是，ACSL4在三陰性乳腺癌細胞亞羣中的表達水平與其對鐵死亡缺乏誘導劑的敏感性相關，這種相關性似乎與耐治療的間充質癌細胞和透明細胞腎癌細胞共有。因此，抑制ACSL4表達可能是細胞對鐵死亡抵抗的主要機制，抗鐵死亡可能受多種信號通路的調節，包括來自細胞間和細胞外基質粘附的信號，這兩種信號在腫瘤發展中經常受到影響。相反，ACSL4表達和/或活性的增加可能在各種病理生理環境下促進鐵死亡，如缺血-再灌注(一種與鐵死亡誘導密切相關的疾病)和對輻射的反應。
儘管毫無疑問，脂質雙層的不飽和度是決定細胞對鐵死亡敏感性的關鍵，但關於脂質過氧化實際上是如何引發的，仍有許多不確定性和爭論。分隔一對二烯的雙烯丙基碳是已知的最弱的碳氫鍵之一，這些結構數量的增加會加快脂質的自氧化速度，這在環境氧張力下含PUFA的食物的變質中是顯而易見的。可以想象，脂質過氧化的非酶引發可以由脂質自由基的自發產生或羥基自由基的產生引發(羥基自由基是活性氧的最具反應性的形式之一，其攻擊大多數有機分子，一旦局部產生(由於其接近擴散控制的速率)，可能由使用鐵作爲催化劑的芬頓反應驅動(圖3)。
某些脂氧合酶(LOXs)是針對多不飽和脂肪酸的非血紅素鐵依賴性雙加氧酶，可直接氧化生物膜中的多不飽和脂肪酸和含PUFA的脂質，提高了LOXs可能介導鐵死亡誘導的前景。這種可能性得到了以下觀察結果的支持:lox的一些藥理學抑制劑可以抑制鐵死亡敏感性，Alox15敲除或應用LOX抑制劑黃芩素可以保護小鼠免受缺血性腦損傷。儘管如此，在Gpx4敲除背景上遺傳性去除Alox15未能防止小鼠成纖維細胞的鐵死亡，也未能防止急性缺血性腎損傷和體內相關的致死性，也未能恢復因T細胞特異性Gpx4-/-小鼠中的鐵死亡而損失的CD8+ T細胞羣。然而，值得注意的是，lox主要與半胱氨酸飢餓誘導的鐵死亡有關，而不是由GPX4缺失誘導的鐵死亡，因此有必要使用不同的模型進一步剖析lox在鐵死亡中的作用。這些數據表明，替代機制可能補償ALOX15活性的損失，LOXs可能僅涉及鐵死亡的某些情況，和/或常用的“LOX特異性”抑制劑作爲自由基捕獲抗氧化劑發揮非特異性活性，並能夠通過這種活性防止鐵死亡。事實上，最近的一項研究證實，最常用的LOX抑制劑具有自由基捕獲抗氧化活性，從而挑戰了LOXs在鐵死亡中的普遍作用。此外，所有人LOX同功酶的聯合下調未能防止RSL3誘導的鐵死亡，儘管它對erastin誘導的鐵死亡提供了實質性的拯救，這可能是因爲erastin治療與LOX酶活性有關。因此，LOXs在大多數情況下可能不是鐵死亡的關鍵驅動因素，但在某些情況下可能會導致損傷的發生和/或傳播。與此相一致，Alox15或Alox12的缺失分別在神經變性或癌症抑制小鼠模型中顯示出保護作用。然而，應該強調的是，這些酶通過產生促炎和抗炎分子直接調節(神經)炎症過程和腫瘤微環境，在免疫系統中發揮重要的生理作用；因此，其損失的有益效果不一定與鐵死亡直接相關。與這一概念同樣相關的是以前的發現，即GPX4通過所謂的細胞過氧化物酶活性(即細胞中低水平過氧化物的持續維持)控制LOXs的活性和環氧化酶的活性，因爲這兩種酶都需要通過脂質氫過氧化物氧化其鐵來捕獲分子氧並將其結合到PUFAs中。值得注意的是，據報道，ALOX12對於由過氧化物觸發的p53依賴性鐵死亡是必需的，並且這種形式的鐵死亡是相當獨特的，因爲它似乎獨立於ACSL4，這意味着p53-ALOX12驅動的鐵死亡可能通過不同的脂質起作用，而不是由GPX4缺失或半胱氨酸缺乏驅動的鐵死亡。此外，據報道磷脂酰乙醇胺結合蛋白1(PEBP1)與某些lox複合，改變了它們對PUFA-PLs的底物特異性。
除了LOXs在鐵死亡中的作用尚不清楚，最近的發現表明普遍表達的細胞色素P450氧化還原酶(POR)在啓動脂質過氧化中起作用。在使用NADPH作爲電子供體接受來自POR的電子後，下游電子受體，如細胞色素P450和CYB5A被還原，這隨後可以通過從多不飽和脂肪酸中除去氫或通過將三價鐵(Fe3+)還原成亞鐵形式(Fe2+)(圖3)直接或間接觸發脂質過氧化反應；如下所述，鐵和亞鐵之間的循環對於芬頓反應和脂質過氧化是至關重要的。