Iron in ferroptosis
從名字本身可以明顯看出，鐵死亡依賴於鐵。首先，非酶促的、鐵依賴的芬頓連鎖反應可能是鐵死亡的必要條件:當GPX4被抑制時，PLOOHs可以持續更長時間，啓動芬頓反應以快速擴增PLOOHs，這是鐵死亡的標誌(圖3)。多羥基化合物可以與亞鐵離子和三價鐵離子反應，分別產生自由基PLO和PLOO，驅動破壞性的過氧化鏈式反應。然而，應該注意的是，至少在這種鐵催化的鏈式反應的起始階段，亞鐵離子可能更佔優勢，因爲鐵離子在細胞中的溶解度和生物利用度相當差。此外，LOX和POR需要鐵來催化。鐵對於過多的氧化還原代謝過程也是必不可少的，這些過程涉及細胞活性氧的產生。
鑑於鐵在細胞存活和死亡中的核心作用，細胞鐵穩態受到精確控制並不奇怪，主要是通過鐵調節蛋白IRP1和IRP2，它們參與參與細胞內鐵儲存/釋放和導入/導出的基因的轉錄後調節。可以想象，許多細胞過程通過改變細胞不穩定鐵的含量來改變細胞對鐵死亡的敏感性。例如，通過鐵儲存蛋白鐵蛋白的自噬降解來增加細胞鐵的可利用性會促進鐵死亡。同樣，轉鐵蛋白及其受體通過將鐵輸入細胞而共同促進鐵死亡。相反，增強細胞鐵輸出的機制已被證明使細胞對鐵死亡抵抗。此外，通過血紅素加氧酶1(HO-1)介導的血紅素降解釋放鐵也與鐵死亡有關；然而，一系列相互矛盾的數據表明HO-1促進或抑制鐵死亡。
最近的小鼠體內模型研究進一步闡明瞭鐵代謝調節在鐵死亡中的作用。例如，鐵蛋白重鏈的基因缺失可能通過增強鐵死亡敏感性而導致心肌病。有趣的是，小鼠肝細胞特異性敲除轉鐵蛋白編碼基因導致了意想不到的表型:用富含鐵的飲食餵養敲除小鼠增加了肝細胞(通常在體內合成轉鐵蛋白的細胞)的鐵負荷。這使得小鼠更容易發生肝纖維化，這可以通過親脂性自由基捕獲抗氧化劑來改善，表明鐵死亡與這種肝臟病理有關。這項研究進一步表明，在缺乏轉鐵蛋白表達的情況下，肝細胞代償性地上調金屬轉運蛋白SLC39A14的表達，導致鐵的過度輸入，進而導致鐵死亡。（主要通過一個體內實驗驗證了鐵死亡在肝纖維化中的作用）
Metabolic inputs into ferroptosis
鐵、脂類、活性氧和胞囊蛋白在鐵死亡中的作用暗示了這種細胞死亡方式和細胞代謝之間的密切聯繫。蔣和他的同事試圖確定新陳代謝是如何決定細胞命運的，他們的研究揭示了鐵代謝與新陳代謝之間的複雜關係。自噬的分解代謝過程是應對各種壓力的關鍵生存機制，但自噬是否以及如何促進細胞死亡(即“自噬細胞死亡”)已經爭論了十年。他們發現，在氨基酸飢餓(一種引發強自噬的情況)時，自噬會促進快速的非凋亡、非壞死形式的細胞死亡，但前提是培養基中要提供全血清。發現鐵載體轉鐵蛋白和血清中的氨基酸谷氨醯胺是這種形式的細胞死亡所必需的，並且從細胞培養基中特異性去除胱氨酸足以引發死亡。對鐵的依賴和胱氨酸的保護作用表明，在這些條件下，鐵死亡是細胞死亡的一種機制。自噬在胱氨酸剝奪誘導的鐵死亡中的作用是通過鐵蛋白的自噬降解(也稱爲鐵蛋白自噬)，導致細胞不穩定鐵含量增加，從而對鐵死亡敏感。
谷氨醯胺代謝或谷氨醯胺分解對胱氨酸剝奪誘導的鐵死亡的需求將鐵缺乏症與氧化代謝聯繫起來。谷氨醯胺是一種關鍵的間變性代謝物，它爲線粒體三羧酸(TCA)循環提供燃料，從而增加線粒體呼吸的速率並增加ROS的生成潛力。因此，線粒體的正常代謝功能似乎與鐵死亡有關——這一結論隨後通過各種藥理學、細胞和遺傳學分析得到驗證。值得注意的是，線粒體早些時候被證明是氧化應激的積極參與者。除了線粒體，植物細胞還擁有另一種獨特的細胞器——葉綠體，它可以進行一系列氧化還原合成代謝反應。由於在植物中觀察到依賴於鐵和活性氧的鐵死亡，一個有趣的推測是葉綠體在植物鐵死亡的調節中也可能起重要作用。
基於這些發現，人們也可以提出過多的假設和問題。例如，葡萄糖，線粒體TCA循環的主要燃料，會調節鐵死亡嗎？事實上，葡萄糖飢餓最近被證明可以抑制鐵死亡，80。然而，從機制上看，這似乎主要是由於關鍵能量傳感器AMP激活激酶(AMPK)介導的信號傳遞，而不是TCA和線粒體呼吸的調節(稍後詳述)，這表明鐵死亡有多種代謝輸入，目前尚不清楚。與此相關的是，如果谷氨醯胺的鐵死亡功能僅僅是通過其支持線粒體呼吸的作用，那麼谷氨醯胺對於胱氨酸剝奪誘導的鐵死亡是必不可少的，即使細胞在大量葡萄糖的存在下培養，葡萄糖應該單獨支持TCA活性並確保高呼吸潛力。此外，作爲鐵死亡的基礎，線粒體代謝是通過產生特定的脂質前體用於PLOOH合成(TCA循環的中間體可以參與脂肪生成)還是通過產生ROS(氧化代謝反應的天然副產物)來促進鐵死亡？線粒體活性和谷氨醯胺分解對半胱氨酸剝奪誘導的鐵死亡至關重要，但對GPX4抑制誘導的鐵死亡不可或缺，這一觀察爲後一種可能性提供了更多支持。（The observation that both the mitochondrial activity and glutaminolysis are crucial for cysteine deprivation-induced ferroptosis, but are dispensable for that induced by GPX4 inhibition, lends more support to the latter possibility.）
GPX4-independent surveillance pathways
雖然胱氨酸-谷胱甘肽-GPX4軸被認爲是阻止哺乳動物鐵死亡的主要機制，但全基因組篩選發現了與GPX 4無關的鐵死亡監測機制。第一種機制涉及鐵死亡抑制蛋白1(FSP1；也稱爲AIFM2)。AIFM1，FSP1的同源物，最初被認爲是促凋亡的(如FSP1/AIFM 2)，現在認爲與線粒體膜間蛋白的運輸和正確摺疊有關。類似地，FSP1缺乏實質性的促凋亡功能，但事實上保護細胞免受GPX4抑制或基因缺失誘導的鐵死亡。FSP1是肉豆蔻酰化的，與幾種細胞膜結構相關，包括質膜、高爾基體和核周結構。肉豆蔻酰化位點的突變取消了它的抗鐵死亡功能。從機理上來說，由於其NADH:泛醌氧化還原酶活性，FSP1通過還原泛醌(或其部分氧化產物半氫醌)產生泛醌醇來抑制脂質過氧化和鐵死亡，泛醌醇又可以直接還原脂質自由基以終止脂質自氧化，或者通過再生氧化的α-生育酚自由基(維生素E)來間接抑制脂質過氧化和鐵死亡。泛醌的這種保護作用揭示了一個長期以來的謎，即爲什麼一些細胞和組織，如高代謝活性的肝細胞，含有大量線粒體外泛醌，這與其在線粒體電子轉運鏈中的典型作用不一致。
在另一項研究中，據報道GTP環水解酶1 (GCH1)通過其代謝產物四氫生物蝶呤(BH4)和二氫生物蝶呤(BH2)來防止鐵下垂死亡。BH4被證明能保護含有兩個PUFA尾的磷脂免受氧化降解，這可能涉及雙重機制:作爲一種直接的自由基捕獲抗氧化劑和參與泛醌合成，90(圖2c)。雖然Gch1在保護組織和器官免受鐵死亡方面的作用仍有待闡明，但基因敲除研究表明，小鼠失去GCH1會導致妊娠中期心動過緩和胚胎死亡。
除了這些直接作用於脂質雙層中的過氧化物或通過天然存在的自由基捕獲抗氧化劑作用於磷脂自由基的系統之外，還可能存在保護免受有害脂質過氧化的其他細胞內在機制。據報道，膽固醇途徑的代謝產物角鯊烯的積累在膽固醇營養缺陷型淋巴瘤細胞系和原發性腫瘤中具有抗鐵死亡活性，儘管這是一種癌症亞型特異性作用還是一種一般的保護機制仍有待證明。
Regulation of ferroptosis
可以想象，調控鐵死亡相關促進或監測分子、氧化還原和鐵穩態以及細胞代謝的生物過程會影響鐵死亡過程。正如預期的那樣，氧化應激反應轉錄因子NRF2可以通過刺激其多個典型靶基因的表達來減輕鐵死亡。此外，越來越多的證據表明，在特定的生物學環境下，多種信號通路可以決定細胞對鐵死亡的敏感性。
Regulation of ferroptosis suppressors
儘管GPX4和FSP1在限制鐵死亡方面具有重要意義，但關於細胞在生理和病理條件下如何調節其抗鐵死亡潛能的研究卻知之甚少。然而，似乎GPX4和FSP1至少在某種程度上與甲羥戊酸途徑相交:該途徑的輸出之一，異戊烯基化，穩定硒代半胱氨酸特異性tRNA(Trsp)，這是合成包括GPX4在內的硒代酶所必需的，並且作爲甲羥戊酸途徑的最終代謝物之一，泛醌是FSP1的主要底物，如上所述。
GPX4是人類25種硒蛋白之一，因此其表達受細胞硒利用率的調節。例如，在出血性中風小鼠模型中，硒補充被證明通過協調激活轉錄因子TFAP2c和Sp1來提高神經元中GPX4的表達，這可以保護組織免受損傷。然而，應該注意的是，GPX4可以被認爲是一種管家蛋白，在大多數組織和器官中組成型表達，不像真正的硒響應蛋白，如硒蛋白P(SELEOP)、GPX1和GPX3。據報道，其他調節GPX4表達的轉錄因子包括腸細胞中的C/EBPα和一些癌細胞中的NF-Y。據報道，轉錄後富含鳥嘌呤的序列結合因子1(GRSF1)與線粒體形式的Gpx4 mRNA的5’非翻譯區結合，導致在精子發育過程中起重要作用的線粒體GPx4翻譯增加。然而，這些調節事件與鐵死亡的相關性仍未確定。
越來越多的證據表明GPX4也在活性和穩定性水平上受到調節。例如，由於持續的氧化應激和伴隨的谷胱甘肽缺乏，活性位點硒代半胱氨酸的谷胱甘肽依賴性減少受損，可能通過稱爲β-裂解的過程中形成氧化還原死亡的脫氫丙氨酸而導致GPX4的不可逆失活。低水平的谷胱甘肽也可能引發硒酸和相鄰氨基酸之間形成硒酰亞胺，從而保護酶在急性氧化應激條件下不可逆失活。然而，需要進一步探索這些機制是否在病理狀態下發揮作用，如缺血-再灌注損傷；據報道，腸缺血與低得多的GPX4活性和水平有關。此外，包括RSL3在內的幾種公認的鐵死亡誘導劑，通過包括活性位點硒代半胱氨酸共價修飾、甲羥戊酸代謝破壞和一般鐵依賴性氧化應激在內的機制，最終導致GPX4的活性、合成和穩定性受損。
作爲一種突出的鐵死亡抑制基因，FSP1最初被描述爲p53應答基因，因此最初被稱爲p53應答基因3 (PRG3)。FSP1是轉錄因子NRF2、CRBP107和PPARα108的靶標。有趣的是，在T細胞成淋巴細胞淋巴瘤細胞中，據報道FSP1的表達被母體表達的長非編碼RNA 3(MEG3)上調，並被miR-214抑制，miR-214是兩種參與腫瘤發展的調節性RNA。除了轉錄調控之外，幾乎沒有人知道FSP1的氧化還原酶活性是如何調控的，以及它的亞細胞定位如何影響它在不同生理和病理生理過程中的作用。但FSP1對還原和氧化底物(包括NADH、NADPH、泛醌和α-生育酚)的混雜性表明其活性的複雜調節。
Hippo–YAP signalling in ferroptosis
Hippo–YAP途徑涉及無數的生物功能，包括細胞增殖和器官大小控制。對這一途徑在鐵死亡中的作用的研究始於一項觀察，即高密度生長的細胞通常更能抵抗半胱氨酸剝奪和GPX4抑制誘導的鐵死亡。這一觀察令人想起早期的報告，重要的是包括在極高密度下培養或作爲球體培養(細胞間接觸是優選的)促進Gpx4敲除細胞存活的證明。從機制上講，上皮細胞鐵死亡的細胞密度效應是由E-鈣粘蛋白介導的細胞-細胞接觸介導的，這種接觸通過NF2(也稱爲Merlin)腫瘤抑制蛋白激活河馬信號，從而抑制核易位和轉錄共調節因子YAP的活性。因爲YAP針對幾種鐵死亡的調節因子，包括ACSL4、轉鐵蛋白受體TfR1和其他可能的調節因子，鐵死亡的易感性將不可避免地依賴於海馬通路的活性，對海馬通路的抑制和YAP激活使鐵死亡的易感性增加(圖4)。與這一發現相一致的是，在主要表達TAZ而非γ-氨基丁酸的腎癌細胞中，TAZ是γ-氨基丁酸的近親，也顯示出以細胞密度調節的方式增強鐵死亡。
E-鈣粘蛋白-NF2-HIPPO-YAP/TAZ通路在決定鐵死亡中的作用具有重要意義。首先，由於該途徑的多種成分在癌症中經常發生突變，主要導致YAP/TAZ表達和/或活性增加，鐵死亡誘導可能被用作治療這些特定癌症的潛在治療方法，這一主題將在下面進一步討論。其次，由於在不表達E-鈣粘蛋白的非上皮細胞中也觀察到這種細胞密度依賴性鐵死亡，因此應該考慮其他鈣粘蛋白或細胞粘附分子也可以介導抑制鐵死亡的類似機制。第三，HIPPO-YAP通路在發育中很重要，並與各種其他信號通路相互作用，從而在鐵死亡和正常細胞生物學之間提供了大量潛在的聯繫。最後，我們很容易推測鈣粘蛋白可能是保護細胞免受氧化應激的挑戰及其最具破壞性的後果——鐵死亡。
AMPK signalling and ferroptosis
直覺上，能量和代謝壓力會導致能量損失，從而導致維持體內平衡所需的系統級聯失效，如細胞膜上依賴能量的離子梯度，最終導致細胞死亡。此外，葡萄糖飢餓的代謝應激細胞增加了ROS的產生，表明葡萄糖飢餓促進了鐵死亡。令人驚訝的是，葡萄糖飢餓阻斷鐵死亡。發現這種保護作用依賴於能量感應激酶AMPK的活性。因此，當葡萄糖不存在時，AMPK被激活，啓動一個針對鐵缺乏症的能量應激保護程序，該程序涉及多不飽和脂肪酸的生物合成受損，而多不飽和脂肪酸對於脂質過氧化驅動的鐵死亡是必不可少的。這一發現具有實際應用價值，因爲發現激活這一能量應激程序可以預防腎缺血-再灌注損傷。通俗的說，這種保護機制可能是抵禦器官損傷的第一道防線，器官損傷可能與能量衰竭有關。
Hypoxia signalling and ferroptosis
鑑於鐵動力細胞死亡是由磷脂過氧化作用驅動的，一個長期存在的問題是它是否取決於氧濃度，因爲分子氧可以首先被各種酶代謝爲超氧陰離子(O-)，然後經過歧化形成過氧化氫(H2O2)。然而，一項早期的鐵死亡研究表明，在1%的氧氣中，對erastin誘導的鐵死亡的敏感性幾乎沒有損失，這表明缺氧不能抑制鐵死亡。事實上，有證據表明缺氧促進了鐵死亡。首先，應考慮缺氧與線粒體複合體ⅲ產生的活性氧增加有關，線粒體複合體ⅲ可通過損傷線粒體膜直接導致脂質過氧化，導致細胞內H2O2水平升高以支持芬頓反應和/或通過壓倒細胞的抗氧化能力來起作用。此外，缺氧驅動缺氧誘導因子(HIFs)的激活，最近對透明細胞癌的研究發現，這些細胞對GPX4抑制誘導的鐵死亡的高敏感性是由HIF2α亞型驅動的。在這種情況下，缺氧誘導因子2α被證明是缺氧誘導的脂滴相關蛋白(HILPDA)表達的原因，然後驅動多不飽和脂質的富集。透明細胞癌在組織學染色時具有特徵性的透明細胞質染色，並且難以治療，這表明了這一發現的臨牀意義。此外，推測HIF2α–HILPDA驅動的對鐵死亡的敏化作用可能是一種消除新生缺氧腫瘤的古老方法也很有誘惑力。
Biological functions of ferroptosis
鐵死亡的機制表明了它潛在的進化起源:自從地球上的生物開始使用氧氣驅動新陳代謝，主要是通過一系列化學氧化還原反應，過渡金屬鐵已經成爲催化這些反應的主要因素。這種鐵依賴的氧化還原代謝不可避免的副產品是活性氧，包括多羥基化合物。當多能幹細胞的細胞水平超過某個閾值時，細胞就會發生鐵死亡。可以想象，GPX4和FSP1等多種監測機制已經進化爲保護細胞免受鐵死亡。因此，推測起來，鐵死亡可能是在富含鐵和氧的環境中出現的最古老的調節細胞死亡形式。但是鐵死亡有什麼有益的、生理上相關的作用嗎？理論上這是可能的。一個相關的例子可能是活性氧和脂質氫過氧化物。這些物種最初被認爲僅僅是新陳代謝的有毒“副產品”，但我們現在知道它們賦予基本的生理功能，例如細胞信號和免疫，它們是在幾個亞細胞位點故意產生的，以調節細胞生理事件。類似地，鐵死亡也可能被用來完成對生命有益的任務。越來越多的證據，儘管是間接的，表明鐵死亡在腫瘤抑制和免疫監視中的生理功能。
Ferroptosis in tumour suppression
多種腫瘤抑制因子已被證明能使細胞對鐵死亡敏感。因此，一個合理的假設是鐵死亡有助於這些腫瘤抑制因子的抗腫瘤活性；也就是說，腫瘤抑制可能是鐵死亡的先天生理功能。在這些腫瘤抑制因子中，p53參與了鐵死亡的研究。通過對p53特異性賴氨酸乙酰化位點的詳細分析，發現p53可以通過抑制系統xc-亞單位SLC7A11的轉錄來增強鐵死亡，並且這種功能可能有助於p53在體外和體內的腫瘤抑制功能。此外，p53的易患癌單核苷酸多態性導致P47S氨基酸取代，被發現賦予癌細胞對鐵死亡的抗性。然而，尚不清楚p53促鐵死亡活性的喪失是否是這些特異性突變引起的唯一功能性後果。值得注意的是，與這些研究相反，也有報道稱p53通過調節其其他轉錄靶點來預防鐵死亡。鑑於p53可以調節一大羣參與各種生物過程的靶基因，它在鐵死亡中的確切作用很可能取決於環境。
與p53相似，腫瘤抑制因子和表觀遺傳調節因子BAP1也可以通過下調SLC7A11的表達來促進鐵死亡。但是與p53不同，p53的鐵死亡促進活性單獨被認爲足以抑制體內中的腫瘤發生，尚不清楚BAP1的鐵死亡促進活性對其腫瘤抑制功能的貢獻有多大。
延胡索酸酶是一種在TCA循環中催化延胡索酸轉化爲蘋果酸的酶，是平滑肌瘤和乳頭狀腎細胞癌中真正的腫瘤抑制劑。這種酶對TCA循環活動至關重要，因此對細胞能量和代謝物的產生也至關重要，但它是如何反直覺地抑制腫瘤生長的，以及它是如何僅在少數特定癌症類型中抑制腫瘤生長的，目前尚不清楚。延胡索酸酶參與線粒體TCA循環的促鐵死亡功能使這些問題變得清晰。癌症的發展通常與線粒體活性氧生成的增加有關，這爲這些細胞的鐵死亡提供了條件。延胡索酸酶功能的喪失將影響線粒體的氧化功能，這一方面將損害生長能力，但另一方面，將使細胞對鐵死亡更具抵抗力，從而提高它們的存活率和癌變的可能性。
Ferroptosis in immune surveillance
與其他形式的調節性細胞死亡不同，如凋亡、焦脫和壞死，它們顯然是由免疫系統參與調節免疫反應的，但很大程度上仍然不清楚通過外源性或內源性機制引起的敏化或觸發鐵死亡是否可以發揮類似的“生理作用”。有一些初步證據表明，鐵死亡在免疫細胞誘導細胞死亡方面可能很重要。一份報告表明，系統xc-的表達被幹擾素-γ(IFNγ)抑制，CD8+T細胞產生的這種細胞因子最近被證明與腫瘤細胞對鐵死亡的敏化有關。免疫細胞誘導鐵死亡的這種直接機制是否與生理相關仍不清楚。另一份報告表明，白細胞介素-4和白細胞介素-13抑制某些細胞(包括腎、肺、脾和心臟)中GPX4的表達，同時ALOX15的表達增加，從而允許花生四烯酸代謝物的大量產生。由於已知GPX4通過降低脂質過氧化物濃度來抑制LOXs和環氧化酶的活性，因此GPX4的活性受損可能對免疫調節脂質介質的分泌產生深遠的影響，這反過來可能通知免疫系統處於鐵死亡敏感狀態的細胞的存在，從而有助於免疫監測(檢測損傷或惡性腫瘤)。
鐵死亡在免疫反應中的潛在功能並不侷限於哺乳動物系統，也可能與植物有關。最近的一份報告表明，在水稻中，誘導鐵死亡樣細胞死亡——與脂質過氧化有關，並受到鐵螯合劑的抑制——通過清除受感染的細胞和防止病原體擴散來防止真菌稻瘟病菌的感染。有趣的是，米麴黴特定細胞的類似鐵死亡的死亡是其在宿主中發育所必需的。因此，這一發現也首次暗示了鐵死亡的潛在發育作用。