轉基因、基因敲入/敲除動物技術已經成爲現代生命科學基礎研究和藥物研發領域不可或缺的重要技術，該技術從上世紀七八十年代誕生以來，至今已有近四十年的歷史，經典技術如DNA原核顯微注射、胚胎幹細胞顯微注射技術一直以來經久不衰，在小鼠模型構建方面日趨完善，並且如同剪切酶和抗體等常規分子生物學試劑的製備技術一樣，逐漸從基礎研究實驗室轉向商業模式，成爲一項高度標準化的新興產業，催生了數以百計的創新藥物和數以千計的優秀文章。儘管如此，傳統技術仍然存在一些難以克服的缺陷，如步驟繁瑣、週期漫長、成功率低、費用高昂等，而ZFN和TALEN等新技術的出現，或有可能將這一局面徹底改變。
基因敲除鼠技術是上世紀80年代中後期基於DNA同源重組的原理發展起來的，Capecchi和Smithies在1987年根據同源重組（homologous recombination）的原理，首次實現了ES的外源基因的定點整合（targeted integration），這一技術稱爲"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用這種ES的顯微注射就可以製作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由於這一工作，Capecchi和Smithies於2007年與Evans分享了諾貝爾醫學獎。
同源重組（homologous recombination）定義：是指發生在姐妹染色單體（sister chromatin) 之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內的重新組合。在基因敲除小鼠製作過程中，需要針對目的基因兩端特異性片段設計帶有相同片段的重組載體，將重組載體導入到胚胎幹細胞後外源的重組載體與胚胎幹細胞中相同的片段會發生同源重組，如圖1所示：
圖1.基因敲除鼠製作同源重組原理示意圖
圖2.基因敲除鼠製作過程示意圖
1、Knockout載體設計與構建
根據研究項目具體情況和要求把目的基因和與細胞內靶基因特異片段同源的DNA 片段都重組到帶有標記基因(如neo 基因，TK 基因等)的載體上，成爲重組的Knockout載體。
2、Knockout ES細胞篩選
Knockout載體測序驗證正確後，將載體線性化，然後電轉入ES細胞，通過載體上的正負篩選基因獲得陽性的Knockout ES克隆。選取PCR鑑定打靶載體正確插入的ES基因組DNA用於Southern Blot鑑定，將Southern Blot鑑定的Knockout ES擴大培養並液氮保存。
3、Knockout ES細胞囊胚注射得到嵌合體小鼠
擴增經鑑定插入或置換片段位置正確的Knockout ES細胞，以囊胚顯微注射的方式將一定數量的Knockout ES細胞注入特定品系小鼠囊胚中，然後將囊胚移植到假孕的小鼠子宮中。待後代小鼠出生後，通過小鼠的毛色中來源於ES細胞毛色的比例判斷嵌合程度的高低，以及該小鼠的後代中可能獲得生殖系傳遞能力。
4、由嵌合體小鼠繁殖出生殖遺傳系Knockout 小鼠
將嵌合體小鼠與適當品系的小鼠交配，後代小鼠出生後，通過PCR方式檢測小鼠是否含有打靶序列。如有，則該小鼠爲具備生殖遺傳能力的Knockout小鼠(F1代鼠)。
5、Knockout小鼠生殖系傳遞鑑定
將嵌合體小鼠和適當品系野生型小鼠交配，通過後代小鼠毛色或PCR基因型鑑定的方法驗證嵌合體小鼠生殖系傳遞能力。
一、常規基因敲除鼠（Conventional Knockout）
常規基因敲除是通過基因打靶，把需要敲除的基因的幾個重要的外顯子或者功能區域用Neo Cassette 替換掉。這樣的小鼠其全身所有的組織和細胞中都不表達該基因產物。此類基因敲除鼠一般用於研究某個基因在對小鼠全身生理病理的影響，而且這個基因沒有胚胎致死性。
二、條件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout）
條件性基因敲除小鼠是通過基因打靶，把兩個loxP位點放到目的基因一個或幾個重要的外顯子的兩邊。該小鼠和表達Cre酶小鼠雜交之前，其目的基因表達完全正常。當和組織特異性表達Cre酶的小鼠進行雜交後，可以在特定的組織或細胞中敲除該基因，而該基因在其他組織或細胞表達正常。
條件性基因敲除鼠適用範圍爲：（1）該基因有胚胎致死性；（2）用於研究該基因在特定的組織或細胞中的生理病理功能。
三、基因敲入小鼠（Knockin）
基因敲入小鼠是通過基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相應基因位點，使用小鼠的表達調控元件指導目的基因表達。
此類基因敲入鼠一般用於藥物的篩選，信號通路的研究等。
獲得嵌合體及之後品系純化詳細流程:
一、ZFN技術製作基因敲除鼠
ZFN能夠識別並結合指定的基因序列位點，並高效精確地切斷。隨後細胞利用天然的DNA修復過程來實現DNA的插入、刪除和修改，這樣研究人員就能夠隨心所欲地進行基因組編輯。這在過去是無法想象的，傳統的基因敲除技術依賴細胞內自然發生的同源重組，其效率只有百萬分之一，而ZFN的基因敲除效率能達到10%。利用這些技術進行小鼠基因的定點敲除和敲入，可以把時間從一年縮短到幾個月。
這項技術中設計特異性的ZFN是最關鍵的環節，目前研究者採用計算生物學方法設計高特異性的ZFN，但ZFN的脫靶（off target），也就是把不該切的地方切了的問題仍是一個挑戰。也正因爲這個原因，利用ZFN技術進行小鼠的基因修飾還無法完全取代傳統技術。
二、TALEN技術製作基因敲除鼠
TALEN 技術是一種嶄新的分子生物學工具。科學家發現，來自一種植物細菌的TAL蛋白的核酸結合域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有恆定的對應關係。利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結合任意DNA序列的模塊化蛋白，從而達到靶向操作內源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能識別任意目標基因序列，以及識別序列經常受上下游序列影響等問題，而具有ZFN相等或更好的靈活性，使基因操作變得更加簡單方便。然而同樣因爲脫靶的問題，利用TALEN技術進行小鼠的基因修飾仍然無法取代傳統技術。
一、什麼是ES細胞顯微注射？
答：胚胎幹細胞顯微注射是製作基因敲除小鼠的一個最常用的方法。主要過程是將攜帶目的基因的胚胎幹細胞注射到小鼠的囊胚腔中獲得嵌合體小鼠。所得嵌合體小鼠的組織，將同時含有來源於囊胚的細胞和胚胎幹細胞。嵌合體小鼠必須和野生型小鼠配種以決定遺傳改變的生殖系能否傳遞，這樣可能獲得轉基因或打靶基因（來源於胚胎幹細胞）穩定的生殖系傳遞的小鼠。一般情況下，大約能獲得50%繼承了目的基因的後代。
二、嵌合體
遺傳學上用以指不同遺傳性狀嵌合或混雜表現的個體。免疫學上的涵義則指一個機體身上有兩種或兩種以上染色體組成不同的細胞系同時存在,彼此能夠耐受,不產生排斥反應,相互間處在嵌合狀態。在基因敲除鼠中指通過向囊胚注射被外源基因轉化了的胚胎幹細胞，使得發育成爲的個體中含有不同基因型的細胞，產生的個體也叫嵌合體，即該生物體中嵌合了兩種不同遺傳結構的細胞（一種是基因型被改變了的細胞，另一種是原來的基因型的細胞）。
三、條件性敲除的原理？
答：Cre-LoxP系統是源於P1噬菌體的一個DNA重組體系,由Cre酶和相應的LoxP位點組成,它能導致重組發生在特定的DNA序列處(LoxP位點),該系統可以將外源基因定點整合到染色體上或將特定DNA片段刪除。基於Cre-LoxP的基因打靶要分兩步來進行。首先要在胚胎幹細胞的基因組中引入LoxP序列，這一步可以通過打靶載體的設計和對同源重組子的篩選來實現。下一步通過Cre介導的重組來實現靶基因的遺傳修飾或改變。Cre-LoxP系統既可以在細胞水平上用Cre重組酶表達質粒轉染中靶細胞，通過識別LoxP位點將抗性標記基因切除，又可以在個體水平上將重組雜合子小鼠與Cre轉基因小鼠雜交，篩選子代小鼠就可得到刪除外源標記基因的條件性敲除小鼠。
四、如何鑑定和挑選嵌合體？
答：動物只有部分組織細胞整合有外源基因，則稱爲嵌合體動物。它的鑑定主要根據毛色去鑑定。注射的ES和囊胚來源不同的小鼠品系。它們的毛色不同。因此可以根據毛色的嵌合率來鑑定和挑選嵌合體。
五、ROSA26與定點插入？
答：利用同源重組技術，把外面的cDNA片段或者其他DNA片段，定點插入到ROSA26位置。ROSA26是一個安全區域，外源性的基因定點插入這個位點不會影響其他基因的表達。
Taconic Farms,Inc.成立於1952年，是位於紐約哈得孫河谷地區的一家家族企業。自成立以來，公司一直是世界上最大的實驗室齧齒動物供應商之一，在持續生產高品質、定義明確的大鼠和小鼠方面擁有良好的口碑。Taconic在轉基因小鼠的定製設計和生產、小鼠和大鼠育種、屏障系統、基因和動物健康方面的專業經驗爲利用活體模型開展藥物開發的研究人員提供支持。Taconic在美國和歐洲設有六個育種工廠和三個服務實驗室，員工人數超過1000名，致力於從事技術創新。
賽業生物科技是目前國內最大的轉基因/基因敲除鼠技術服務供應商，旗下的賽業轉基因動物中心是國際頂尖的轉基因/基因敲除模式動物中心，中心擁有數千平方米實驗場地，動物種羣規模超過10萬隻，每年可構建轉基因鼠模型3000例及基因敲除鼠模型300例，累計構建轉基因/基因敲除鼠模型數千例。中心主要提供轉基因小鼠、基因敲除小鼠、基因敲入小鼠等技術服務。