前情回顧：
單細胞時代 || 細胞身份概念的演變
單細胞時代 || 網絡分析應用進展，機遇與挑戰
單細胞時代 || 從衆病之王到希望之光
單細胞時代 || 宿主-微生物組相互作用
Host-Microbiome Interactions in the Era of Single-Cell Biology
單細胞不是一個技術而是一個層次，會給此前的生命科學領域帶來新的視角。在本文中，我們跟着一篇綜述來看看單細胞技術如何爲腸道菌羣研究帶來新的希望。你看，圍繞腸道菌羣已經開發的單細胞技術有：
scDual-Seq: mapping the gene regulatory program of Salmonella infection by host and pathogen single-cell RNA-sequencing
Highly Multiplexed Spatial Mapping of Microbial Communities
Prokaryotic single-cell RNA sequencing by in situ combinatorial indexing
MAPS-seq: magnetic bead-assisted parallel single-cell gene expression profiling
Single-cell genomics of uncultured bacteria reveals dietary fiber responders in the mouse gut microbiota
微生物是最普遍的生命形式，但是對於微生物的多樣性（diversity）我們知道的還很少。近年來，隨着測序技術的出現（mNGS,16S,metagenome），人們對它們在調節宿主生理方面的作用有了更深入的認識，微生物已成爲人類健康和疾病生物學研究的前沿。儘管如此，由於核酸和細胞分析方法的出現，捕獲微生物及其誘導的宿主反應的異質性（heterogeneity）一直頗具挑戰性。通過基因組學、轉錄組學和空間組學，單細胞分析領域是我們對複雜生物理解的最新技術。這些技術顯著地促進了我們對宿主生物學的理解，但只是在最近才應用於微生物研究，闡明瞭它們的多樣性以及在共生和致病背景下與宿主細胞的相互作用。
在這篇綜述中，我們回顧新興技術的應用及其將爲理解微生物異質性提供新的見解。然後，我們詳細研究了宿主單細胞分析如何揭示微生物對宿主異質性的影響以及宿主生物學對微生物的影響。如果沒有單細胞分析的出現，這些見解將是具有挑戰性的，在某些情況下是不可能的。這表明了單細胞範式對於微生物學領域向前發展的重要性，通過宿主-微生物組的視角，應用這些見解來更好地理解和治療人類疾病。
微生物是地球上主要的生命形式，據估計地球上大約有個細菌細胞和古菌。最近的一項估計顯示，地球上有人居住的微生物物種數量爲
種。儘管有巨大的生態多樣性和普遍性，微生物仍然是一些最不具特徵的生物，可能有超過99%的微生物類羣尚待發現。據估計，每個人體內都有
個微生物細胞，這個數字相當於我們體內的體細胞數量。不可否認，對人體微生物組的更全面瞭解也會使我們對人類健康和疾病有更深入的瞭解。事實上，在過去的十年中，許多研究表明微生物組與人類疾病有關，包括炎症性腸病、癌症、中樞神經系統障礙、血管疾病以及肥胖。
在過去的幾十年裏，研究微生物組的測序和模型系統的技術進步極大地促進了生物發育和疾病病理中的作用。無菌人源化小鼠作爲一種研究模型生物微生物組的方法被廣泛採用。同時，在基因組水平上，最常用的鑑定方法包括16S核糖體DNA (rDNA)測序、元基因組和元轉錄組測序、微生物組代謝組學鑑定等，以更好地瞭解微生物組的組成和菌落水平的特徵。
儘管有了以上進展，儘管它在表型可變疾病如IBD的背景下的重要性已經得到了一定的的認識，但對微生物組異質性的理解仍有挑戰。特別是，通常使用的方法往往失去了跨菌落和物種內部的微生物的空間和細胞分層。最近在單細胞分離和測序技術的進展提供了一個潛在的解決方案，然而，一些因素阻礙了傳統的單細胞測序方法在微生物特性方面的研究。
- 低的DNA和mRNA含量限制了從單個細胞中進行測序分析的合理數量的遺傳物質。
- 細菌mRNA缺乏聚腺苷化限制了其與rRNA的分離。
- 此外，細胞壁和細胞膜的多樣性對單細胞RNA測序(scRNA-seq)所需的持續裂解或滲透提出了挑戰。
一些技術已經開始處理上述的限制。熒光激活細胞分選(FACS)已被應用於未培養的微生物，以實現單細胞分離，然後裂解，全基因組擴增(WGA)，以及基於16S rrna的細胞鑑定。微流體技術在細胞分離中的應用在微生物學領域迅速發展，實現了對單細胞微生物基因組的高通量分離、片段化和條形碼(Lan et al.， 2017)。單滴多位移擴增(Single droplet multiple displacement amplification，sd-MDA)捕獲皮升滴中的單個細胞，然後進行全基因組擴增，保持單基因組特異性的完整性。然而，這種方法的一個侷限性是MDA會放大DNA污染，產生不均勻的reads覆蓋，導致嵌合片段連接不相鄰的模板序列(Zhang et al.， 2006)。凝膠微滴培養是一種方法，單細胞捕獲瓊脂滴，並在MDA之前生長到數百個細胞。雖然這允許從單細胞擴增基因組，但這可能會產生基於瓊脂細胞培養要求的採樣偏差。
下面，我們將重點介紹一些新興技術，這些技術用於在單細胞分辨率下更好地描述人類固有的微生物組以及宿主-微生物組關係。這些進步可以被歸類爲在微生物組細胞水平上的基因組和轉錄多樣性以及在菌落水平上賦予異質性的微生物的空間分佈。
在單細胞分辨率下的微生物組研究
- 解決分類學和功能的異質性
微生物單細胞基因組學是一個最近和迅速出現的領域。爲真核細胞開發的單細胞基因組學的進展，使得同樣可以應用於原核生物的工具成爲可能。其中一項技術被稱爲分裂測序(SPLiT-Seq)，涉及RNA的組合條形碼編碼，並在單細胞水平上對細菌轉錄組學產生了新的見解。在SPLiT-Seq中，細胞是固定的，通透性的，cDNA是由細胞RNA通過細胞內逆轉錄(RT)生成的，使用條形碼poly-T和隨機六聚體引物以多孔形式生成。多輪的細胞池和隨機分裂，然後是明確的cDNA條形碼，確保高可能性的獨特標籤RNA每個細胞起源。這種技術非常適合於微生物應用，因爲它能夠繞過單細胞分離，並允許無偏性捕獲RNA表達譜，因爲轉錄的隨機六聚體捕獲。
爲了實現mRNA的富集，最近的一項研究利用大腸桿菌聚(a)聚合酶I (PAP)在細胞中優先富集聚腺苷酸mRNA。這項研究特別應用了分裂池，稱爲“微分裂”，以識別在一系列應激反應、代謝途徑和細菌生長髮育中具有不同基因表達模式的各種細菌亞羣。通過對大腸桿菌MW1255和枯草芽孢桿菌PY79細胞的熱休克暴露分析，確定了管家和應激反應sigma因子的時間激活，並將其組織成細菌羣的亞羣。進一步的分析揭示了碳利用調控、脅迫響應、金屬吸收和發育決策在生長階段的時間變化，表明亞種羣在廣泛的途徑上存在異質性。此外，另一個關鍵發現是在合格狀態的轉錄標記富集的後期的細菌。參與微生物相互作用的微生物和宿主細胞的單細胞特性鑑定技術。微生物可以通過多種單細胞基因組學、空間特性和組合空間基因組技術來研究。(A)微生物分裂池連接轉錄組(microSPLiT -pool ligation transcriptomics, micro - split)利用多輪細胞池和隨機分裂，按細胞來源對cDNA進行唯一的條形碼，從而實現對RNA表達譜的無偏捕獲，並繞過了單細胞分離的要求(Kuchina et al.， 2019)。
一種類似的使用分裂池測序的技術也被開發出來，稱爲原核表達譜，通過標記RNA的原位和測序(PETRI-seq)。PETRI-seq由三個主要組件組成:細胞準備、分裂池條形碼和建庫。microSPLiT協議中的幾個顯著差異包括缺少優先mRNA捕獲和使用AMPure XP beads純化細胞裂解液中的cDNA時使用鏈黴親和素捕獲純化cDNA。PETRI-seq能夠通過不同生長階段對單個大腸桿菌細胞進行強有力的鑑別，發現穩定期相關基因表達、核糖體蛋白表達和氨基酸生物合成的預期趨勢。使用PETRI-seq，作者應用主成分分析對6663個金黃色葡萄球菌單細胞轉錄組進行了檢測，能夠檢測到一個稀有的亞羣(0.04%)接受原噬菌體誘導的細胞，富集了SA3usa原噬菌體的裂解基因。
另一項最近應用於微生物分析的技術是單擴增基因組(SAG)測序。SAG測序的一種特殊變體稱爲SAG-gel，它包括三個步驟:用凝膠珠分離單個細菌細胞，兩輪平行的多重置換擴增(MDA)和多重單基因組測序。第一步是通過微流體液滴發生器在瓊脂糖溶液中進行單細胞封裝。在對含有小滴的單菌進行冷卻後，瓊脂糖聚合形成小珠，然後將其置於細胞裂解試劑和MDA中。經SYBR綠色染色鑑定爲擴增陽性的凝膠珠，然後分選到96孔板中，進行第二輪MDA檢測。按照DNA產量和污染的質量控制步驟，進行全基因組測序。一項研究考察了膳食纖維菊粉對小鼠腸道微生物羣組成的影響。利用16S rRNA基因測序初步在家族水平對細菌應答物進行分類，然後將SAG測序應用於小鼠腸道菌羣，瞭解菊粉餵養後增加的特定細菌對菊粉的利用能力。本研究的一個關鍵發現是利用含有菊粉酶的位點簇鑑定了兩個具有多糖反應的擬桿菌基因組。這些基因組與已知菊粉蛋白使用率相似，被認爲是B.酸化因子的一個潛在的新亞羣。此外，進一步對這兩種有應答的擬桿菌進行基因組分析，與無應答的擬桿菌比較，發現其在輔因子和維生素代謝、氨基酸轉運和生物合成途徑、碳水化合物代謝等保守的生物合成途徑存在差異，提示菊糖應答者在小鼠腸道菌羣中發揮不同的代謝作用。
爲了解決單擴增基因組中存在的偏置基因組覆蓋和嵌合序列問題，一項研究開發了一種新的分析流程，稱爲單細胞擴增基因組的清洗和聯合裝配(ccSAG)。在ccSAG中，首先根據V3-V4區域的16S rRNA相似性和平均核苷酸的一致性，將原始菌株分組。原始contigs由這些凹陷組成，在組內進行比較，並被分類爲乾淨的、未映射的或潛在的嵌合讀區。嵌合體根據原始contigs的對齊情況進行分割並重新映射。交叉引用映射和嵌合體分裂的循環最終識別未映射讀並去除嵌合體。最後，將清潔reads重新組裝到複合凹陷弧羣中，並使用原始複合凹陷弧羣進行橋接。這就產生了無間隙的複合單細胞基因組。將此分析方法應用於基於微流體的小鼠腸道微生物的單細胞MDA測序。從這項研究中，擬桿菌菌株內的兩個新的草圖基因組在代謝途徑上存在差異，如鈷胺素生物合成，這表明這些新菌株具有不同的代謝作用。值得注意的是，當比較菌株中SAGs的編碼序列時，在多糖裂解酶基因中檢測到導致氨基酸變化的單核苷酸多態性(SNPs)。由於構建了複合單細胞基因組，傳統的SAG聯合裝配可能忽略了這些snp，而ccSAG的分析方法允許檢測菌株內snp，這表明在同一微生物物種中存在比以前認爲的更大的遺傳和功能異質性。
與流式細胞術和傳統microfluidic-based測序技術,虛擬微流體是發達國家,而不是物理微流體劃分隔離單分子和細胞，大量利用聚乙二醇(PEG)水凝膠來實現diffusion-based沒有分子或細胞間的離散邊界劃分。在這種形式下，小分子和寡核苷酸可以在虛擬的“隔間”之間自由移動，而單細胞和高分子量MDA產品則不能。這種格式允許對單個單元和MDA產品集羣進行簡單的物理訪問，以便進行成像、分析和本地化條形碼。此外，MDA中間體的局部限制可以解決技術限制，如嵌合讀取，提高單細胞MDA產品在更大範圍的完整性。利用該技術對混合培養的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進行了單細胞散彈獵槍基因組測序，成功解決了單細胞擴增產物，沒有交叉污染。在同一項研究中，這項技術被應用於斐濟社區微生物組項目(Fiji Community Microbiome Project)的人類糞便樣本中不同的、無特徵的微生物種類。虛擬微流體識別了一個在霰彈槍數據的標準分類學分配中最初沒有檢測到的微生物家族。這表明了一種無偏倚的單細胞方法(如虛擬微流體法)對微生物分析的重要性，特別是當特定的生物體可能無法在參考數據集中很好地表示時。
每一種方法的發現都是有關微生物特性的基礎發現的例子，否則在批量測序中就會遺漏這些特性，這限制了對細胞間變異的檢測，而這種變異在允許特定亞種羣隨着環境變化而出現時通常是至關重要的。獲得單細胞基因組分辨率的能力具有重要的臨牀意義，如細菌持久性和大型微生物羣落不可培養成分的特性。此外，這些新技術排除了參考基因組的需要。這使得我們可以分析來自宿主的未培養細菌，其中許多細菌還沒有被分類或鑑定，並且開啓了對微生物組組成的新見解。
- 解決空間異質性
基因組測序提供了在單細胞水平上更好地去褶積複雜微生物亞羣的優勢，但也帶來了這樣複雜種羣所包含的空間信息丟失的缺點。目前建立的視覺成像方法在混合羣落中對應變水平的區分提出了挑戰。在這方面，一些研究着眼於提供微生物羣落的單細胞空間信息。
其中一個例子是一個AT-rich核糖體結合位點(RBS)文庫，類似於脆弱擬桿菌(Bf)噬菌體基因上游發現的序列，從中識別出最高表達產生啓動子序列，稱爲PBfP1E6 (Whitaker et al.， 2017)。在擬桿菌中，與常用啓動子相比，pbfp1e6驅動的表達顯示至少一個數量級的熒光，比16S rRNA啓動子高70倍。值得注意的是，該啓動子沒有檢測到降低菌株在體內的適應度。通過突變分析，創建了一系列不同強度的可互換啓動子，表達範圍達3萬倍。六種不同的擬桿菌被設計成基於不同水平的GFP和mCherry表達組合產生獨特的熒光特徵。這些可以在低細胞識別錯誤(約6%)的體內被識別。作爲這項技術的結果，作者試圖檢驗擬桿菌在小鼠腸道的隱窩（crypt ）定植對隨後同種菌株的定植嘗試的影響。內腔關聯在維持定殖中被認爲是重要的，然而，這個特殊的研究允許空間分辨率的等基因菌株定位。值得注意的是，順序定殖導致第二株菌的整體定殖明顯較低，這在內腔相對於管腔處被大大誇大，這進一步證明內腔定殖在腸道內的擬桿菌固結中起着重要作用。這項研究是一個早期的例子，說明如何利用分子工具來提供應變水平的分辨率，以揭示腸道微生物的定植異質性。
熒光原位雜交(FISH)分析的目標是rRNA分類鑑定和可視化目前存在，但在分類分辨率有限。最近發展的基於熒光的檢測方法的一種改進是高系統發育分辨率FISH (HiPR-FISH)。該技術通過使用兩步過程的二進制條形碼系統提供了高多路複用性:第一步利用分類特異的16S rRNA探針，而第二步涉及與一組熒光標記讀出探針的雜交。用熒光讀出的分類特異的16S rRNA探針的解耦使這項技術的規模擴大到足夠多的獨特組合，以研究自然中複雜的微生物生態系統。爲了實現單細胞定量，作者對現有的單細胞圖像自動分割算法進行了改進，該算法在HiPR-FISH後進行了多次像素分類和濾波以進行圖像優化。
該方法可對人口腔菌斑微生物組中的微生物種類進行定量物理分析。具體地說，以前未在成像實驗中描述的特殊屬細胞的新型微結構——可能是由於它們的低發病率——能夠從這項工作中得到讚賞。在小鼠腸道微生物組的應用中，HiPR-FISH圖譜被創建用於兩種不同抗生素治療的小鼠和對照組。作者發現抗生素治療導致小鼠腸道鄰近類羣的空間組織發生特殊變化，這表明在微生物組分析中除了考慮相對物種丰度外，還考慮相對空間生物地理學的重要性。HiPR-FISH技術的獨特優勢在於，對多色條形碼的實時解碼僅需一輪成像，數據採集速度比傳統FISH技術更快。此
外，多路複用的能力與多輪雜交和成像允許進一步分離的初始讀數。
考慮到在基因組和空間水平上都能理解微生物組的新能力，自然的進展是確定如何將這兩種關鍵的信息來源結合在一起，提供微生物組的空間基因組分析。爲此，開發了一種通過測序的宏基因組小區取樣方法(MaPS-seq)，該方法將微生物細胞保存在其原生生物地理環境中，從而創建微生物組的空間圖譜。map -seq首先固定輸入的組織樣本，然後滲透並與含有反向16S rRNA擴增引物的丙烯酰胺溶液孵卵。然後通過低溫珠打裂產生細胞團簇，進行細胞裂解，並通過尼龍網過濾以選擇顆粒大小。這些產生的集羣包含了以地理方式保存的基因組DNA，使空間信息的捕獲成爲可能。然後，這些聚類與含有獨特條形碼的前向16S rRNA擴增引物的凝膠珠共包被，可將凝膠珠光切，以確保在聚合物基質降解時釋放基因組DNA。得到的液滴進行PCR擴增，然後進行液滴分離和深度測序。這些測序reads按照獨特的條形碼進行分組，然後根據細菌操作分類學單位(OTUs)的相對丰度進行分類。
作者應用map -seq研究了小鼠消化道不同區域的腸道微生物羣，特別是迴腸、盲腸和遠端結腸。當比較GI位點時，他們觀察到了分類學上的差異，但是也觀察到了一些共同的關聯，比如在盲腸和結腸中發現了Lachnospiraceae和lactobacillus aceae之間的正相關。這些空間結構表明，儘管環境因素可以可變地塑造微生物區系的局部空間結構，但存在更強的不受環境變化影響的關聯。此外，當應用map -seq研究飲食改變後遠端結腸微生物羣的空間組織時，可以發現低脂、植物多糖爲基礎的飲食中存在特殊的類羣系統發育集羣，而在給予高脂、高糖飲食的小鼠中則沒有觀察到這種亞羣。根據t-SNE分析，來自這兩種飲食的集羣形成了高度不同且重疊有限的羣體，這表明在飲食結構的改變中空間組織發生了重大變化。mam-seq分析技術提供了一個新的層次的洞察，在不同宿主環境和環境擾動的背景下，微生物類羣的空間組織，這將被傳統的方法忽略。
總之，這些研究顯示了用單細胞基因組學和空間特性互補當前可用的宏基因組分析的內在力量。這些分析的結合可能最終使被低估的微生物生物地理學特性得以實現，並闡明宿主微生物羣固有的複雜性，以及環境影響對微生物之間的空間關係和基因組變化的實時影響。
在微生物環境下的宿主異質性的單細胞研究
承認微生物羣落在分類和功能上的異質性，特別有趣的是檢查宿主對微生物挑戰的反應的適應程度和變異性。在單細胞水平上對微生物的分析不僅可以提供對微生物組的洞察，而且提供了更好地描述微生物與其宿主之間的細胞間關係的潛力。這是基本的背景生理學和病理生理學，環境對宿主免疫學的影響，以及宿主細胞在調節微生物組的作用。
- 宿主與共生體的相互作用
對宿主細胞的單細胞分析爲共生體和病原微生物在調節宿主生理中的作用提供了新的見解。其中一項研究對無菌(GF)和無特異性病原體(SPF)小鼠的結腸巨噬細胞進行了單細胞RNA測序。在比較SPF小鼠和GF的所有結腸巨噬細胞簇時，發現SPF巨噬細胞與免疫防禦、抗原遞呈和氧化磷酸化相關的基因表達增加。亞羣級別的分析,兩個巨噬細胞集羣在SPF小鼠表現出明顯增加:第一CD11c + CD206intCD121b +,這顯示在抗原處理相關基因的表達水平高,演講中,脂質本地化和細胞遷移,和第二個集羣CD11c−CD206hiCD121b−,顯示增加interleukin-1基因參與了反應,傷口癒合,脈管系統監管,凋亡細胞間隙,細胞因子的生產。無菌小鼠在巨噬細胞中富集，炎症和應激反應的基因表達降低。這兩個簇被發現來自一個共同的高CCR2表達水平的巨噬細胞前體簇。在CD11c+CD206intCD121b+和CD11c−CD206hiCD121b−細胞中，CCR2的丟失和泛巨噬細胞標誌物的增加遵循假時間過程。通過對結腸MPs不同亞羣的流式細胞術和大量RNA測序分析，驗證了這項工作的有效性。因此，應用scRNA-seq在細胞水平上研究宿主細胞已經確定了特定結腸巨噬細胞亞羣的產生依賴於宿主腸道內細菌驅動的分化軌跡。
先天性淋巴樣細胞(ILC)是最近發現的先天性免疫系統的組成部分，是粘膜免疫、炎症和組織穩態的關鍵調節劑。根據轉錄因子的不同表達，輔助型ILCs可以細分爲三種不同的類型，這使得ILCs具有不同的特徵。爲了確定ILCs對微生物組的反應，以及隨後微生物組的變化如何改變ILC生物學，一項研究應用scRNA-seq來揭示ILCs在單細胞水平上對微生物定植的反應。antibiotic-treated和GF小鼠小腸粘膜的分析,作者發現了相似的集羣antibiotic-treated和GF老鼠,都是大大不同於SPF小鼠,暗示類似的效應ilc的預處理或縮短微生物羣損耗。在抗生素處理和GF小鼠中，當比較ILC亞組的相對丰度時，觀察到ILC3和ILC2細胞擴增，ILC1表型缺失。在ILC1和ILC2亞羣中，觀察到ILC2特異性基因的表達急劇下降，同時ilc3特異性基因的表達增加。此外，細胞因子IL-17a的表達，以前被認爲是依賴於微生物組的，在抗生素處理和GF小鼠中，在所有亞組中持續丟失，這進一步證明了微生物組對IL-17a表達的影響。最終，將scRNA-seq應用於與微生物組細胞接近的免疫細胞，揭示了身份和細胞命運調節的細胞水平變化，否則在bulk測序中就會丟失這些變化。
- 宿主與病原體的相互作用
除了共生體，致病性微生物在組成和功能上同樣顯示出高度的羣體內異質性。這就提出了一個問題，即細胞間的差異如何預測或改變病理環境下宿主與微生物的關係。這已經在巨噬細胞感染鼠傷寒沙門氏菌的研究中被探索，以揭示覆雜的，對感染性微生物的異質性免疫反應的潛在機制。近年來，人們對宿主對微生物感染的反應有了更多的瞭解，這已經成爲在單細胞水平闡明宿主免疫-微生物組關係的一個有價值的工具。
由於巨噬細胞對病原微生物表現出不同的反應結果——未感染、病原體破壞感染、病原體持續感染——一項研究對沙門氏菌暴露的小鼠骨髓源性巨噬細胞(BMMs)進行了scRNA-seq，以區分其轉錄變化和免疫應答結果。主成分分析顯示，暴露和未暴露病原體以及感染和未感染巨噬細胞的基因簇使巨噬細胞分層。然而，在巨噬細胞的一個亞羣中誘導了一個富含I型干擾素(IFN)反應的基因簇，發現該基因簇可以區分感染的巨噬細胞和未感染的、病原體暴露的巨噬細胞。在感染的巨噬細胞亞羣中，主要對感染細胞內信號反應的基因比那些對細菌表達細胞外信號反應的基因變異更大。這種差異表明，即使在表型上同質的感染細胞羣體中，也存在內在的異質性。通過對感染巨噬細胞的進一步研究，我們發現沙門氏菌毒力因子PhoPQ的表達水平決定了感染巨噬細胞中I型IFN的誘導水平。PhoPQ可以上調對巨噬細胞內存活至關重要的基因。在本研究中，單細胞分析是鑑定這樣一個羣體的關鍵，因爲I型IFN基因簇在平均分佈於所有細胞時沒有被高度誘導。這項工作強調了致病變異和感染細胞和旁觀者細胞的宿主反應異質性的重要性，表明免疫激活狀態並不是在宿主的一個筒體中運行，但也反映了病原體的內在變異，這些變異隨後導致了宿主的反應。
在本研究的基礎上，另一組試圖探索巨噬細胞如何對極端的細胞內細菌生長異質性作出反應。通過熒光沙門氏菌菌株報告了小鼠BMMs內的細菌增殖情況，作者結合細胞分選和scRNA-seq鑑定了三個巨噬細胞亞羣：初始巨噬細胞和兩組受攻擊巨噬細胞。通過對這兩組受到攻擊的巨噬細胞的分析，發現含有非生長細菌的巨噬細胞的表達譜顯示了促炎M1極化狀態的特徵，並與旁觀者細胞無法區分，這表明非生長細菌逃避了細胞內免疫受體的識別。相反，含有生長細菌的巨噬細胞呈抗炎的m2樣狀態，這表明快速生長的沙門氏菌通過重組巨噬細胞的極化來避免宿主的反應。這被發現是感染的直接結果，因爲這樣的M2標記在原始巨噬細胞中缺失，並被證明與細菌增殖相關。此外，作者還確定了這兩種巨噬細胞極端狀態之間的一系列中間狀態。這項研究證明了最近受到重視的概念，即微生物可以利用宿主基因組的可塑性來實現其自身的維持或增殖的生物學需求。
結合巨噬細胞和原核病原體的測序，另一項研究將scRNA-Seq應用於沙門氏菌感染的巨噬細胞，在單細胞環境下對宿主和病原體進行雙重分析，稱爲scDual-Seq (Avital et al.， 2017)。該方法包括通過隨機六聚體DNA寡聚物啓動逆轉錄，使用條形碼引物進行多路複用，體外轉錄進行RNA擴增，以及配對端Illumina測序。reads的片段被映射到老鼠和沙門氏菌的轉錄組上。通過本研究，作者鑑定了兩類具有不同轉錄特徵的細胞內沙門氏菌，分別爲I類和II類。
此外，他們發現感染巨噬細胞的三個亞羣:部分誘導感染I類沙門氏菌的巨噬細胞，完全誘導感染I類沙門氏菌的巨噬細胞 以及完全誘導感染II類沙門氏菌的巨噬細胞。通過僞時間分析，本研究發現巨噬細胞跟隨從部分誘導狀態到完全誘導狀態的線性進程，同時在沙門氏菌類中發生從I到II的變化。這項研究代表了一種新的範式，通過同時分析兩個轉錄組來研究宿主-病原體的相互作用。儘管表型分解由於感染的多樣性而受到限制，未來的工作可以繼續建立這種宿主和病原體的關聯分析方法。
除了免疫細胞，上皮細胞對病原體的反應也被證明在宿主體內平衡中發揮重要作用。其中一項研究檢測了沙門氏菌和多回蠕蟲對宿主腸上皮細胞的影響。通過基於液滴的scRNA-seq技術，作者對不同感染時間的小鼠小腸上皮細胞進行了分析。對病原體的反應分爲病原體特異性和病原體共享細胞內在的改變和改變腸道細胞組成。在對沙門氏菌的細胞內在反應方面，在所有感染的上皮細胞中，參與細菌防禦反應通路的基因表達發生了變化。有趣的是，一些對沙門氏菌的反應被發現是通過細胞類型特異性的方式誘導的，如各種抗菌肽和促炎蛋白。相反，其他先前被認爲是細胞類型特異性的蛋白質，如抗微生物肽Reg3a，在沙門氏菌感染後在所有細胞類型中都被發現。在蠕蟲感染的反應中，大多數誘導基因是病原體特異性基因，包括炎症反應基因和簇細胞標記。在杯狀細胞中，先前與抗寄生蟲免疫有關的基因被發現被誘導。值得注意的是，在杯狀細胞H. polygyrus反應中發現的一些基因(Wars和Pnlipr2)之前並不知道在這些細胞中表達。H. polygyrus和沙門氏菌感染都導致幹細胞中應激基因模塊的上調。在細胞組成改變方面，沙門氏菌感染導致成熟腸上皮細胞和Paneth細胞增加，同時轉運擴增細胞和幹細胞顯著減少。多回感染顯著增加杯狀細胞和簇狀細胞計數，同時減少腸上皮細胞。這些結果表明，對宿主對病原體的反應有一個更完整的理解，這涉及到對感染的整體和細胞特異性改變的混合作用。本研究揭示了病原體對宿主上皮細胞的實質性特異性作用，包括許多在沒有單細胞方法的情況下未知的發現。
應用我們對宿主-微生物組相互作用的理解，在臨牀環境中尤其相關，因爲患者的結局往往與他們獨特的生理和免疫反應相聯繫。一項研究使用沙門氏菌體外感染人外周血單核細胞(PBMC)模型，對未暴露和暴露的細胞進行scRNA-seq，以揭示感染前後的免疫細胞類型及其亞型。通過這些信息，一種算法被開發，以反捲積體積測量的PBMCs從病原體暴露到細胞類型以及亞羣體依賴於病原體暴露。隨後，這一方法被應用於來自不同疾病階段結核病患者羣體的大量RNA-seq數據。他的算法能夠在基線(出現活動性疾病症狀之前)將潛在的結核病感染者分爲可能發展爲活動性疾病的患者和不會發展爲活動性疾病的患者。這代表了宿主細胞在微生物感染背景下的scRNA-seq的驚人能力，因此單核細胞感染的數據，及其相關特徵，從一種類型的病原體可以用於和應用於其他病原性疾病。這對於感染性疾病患者的預後和由微生物調節的更廣泛的疾病應用具有巨大的臨牀價值。
對病毒感染的宿主的研究類似於細胞內細菌感染，對參與宿主反應的特定細胞類型和途徑有了新的見解。一項研究開發了一種名爲“病毒追蹤”的計算工具來區分病毒感染宿主細胞和scRNA-seq數據中的病毒RNA。這是通過將scRNA-seq數據全面映射到已知病毒基因組數據庫中來實現的。因此，與病毒感染相關的細胞類型可以與未感染的旁觀者細胞羣分開進行分析。在本研究中，viral - track成功識別了多種體內小鼠感染模型和人類臨牀乙肝感染樣本中的感染細胞，並檢測了與病毒複製相關的宿主因子。作者還應用病毒徑跡研究了COVID-19中、重度患者的支氣管肺泡灌洗樣本。該分析揭示了病毒對輕、重症患者免疫細胞的影響差異。輕度患者出現肺泡巨噬細胞富集，重度患者出現中性粒細胞、炎性單核細胞、巨噬細胞和更原始的CD4+ T細胞表型。通過觀察炎症信號來區分嚴重表型:SPP1+單核細胞的炎症趨化因子基因和與缺氧或氧化應激相關的基因上調，而MHC II類和I型IFN基因下調。肺泡巨噬細胞也表現出嚴重相關的特定趨化因子和組織蛋白酶的上調。通過對病毒感染背景下的宿主細胞的分析，本研究顯示了單細胞測序在解剖病毒感染機制方面的廣泛適用性，包括病毒誘導病理中的細胞和分子特徵。此外，它突出了傳統scRNA-seq中未映射到宿主基因組的reads的巨大價值。在臨牀環境中，病毒跟蹤工具是一個例子，說明如何使用scRNA-seq計算管道作爲診斷工具，識別病毒疾病中的免疫調節，並識別聯合感染。
這些研究確定了宿主和病原體轉錄組內細胞間變異的新軸，不僅可以用來了解疾病的發病機制，還可以預測疾病的結果(Penaranda和Hung, 2019)。這項工作強調了單細胞分析宿主和微生物細胞的重要性，當特徵的組織，器官，或複雜的生物體範圍內宿主-微生物關係的表現。
結論
儘管在微生物及其宿主相互作用的單細胞生物學特性方面的技術進展尚不成熟，但該領域出現了幾個共同的主題。首先，單個微生物細胞可以通過多種模式進行高分辨率分析(圖1A-E)，其中許多模式已經從真核生物應用中調整並優化爲微生物使用。因此，人類單細胞生物學的不斷進步很可能會繼續激發和啓發微生物技術。相反，單細胞研究對微生物的獨特挑戰——低RNA和DNA含量，細胞膜和細胞壁的多樣性——挑戰並鼓勵當前技術提高靈敏度和再現性，這有利於微生物和多細胞生物研究(圖1F-H)。
在上述研究中，除了基因組學、轉錄組學和空間分辨率方面的改進外，現在還出現了能夠結合多種分析類型的新方法，這樣研究人員就不需要犧牲一種分析類型來進行另一種分析。這些方法也爲同時研究宿主和微生物的界面開闢了道路(圖1I)。通過對單細胞的研究，在認識共生體在調節宿主生理和細胞分化途徑中的作用方面取得了很大進展。通過應用宿主-病原體的相互作用，這些研究揭示了病原體的異質性對宿主疾病狀態的影響，宿主對感染的新反應，以及細胞和組織水平上的穩態變化。這些見解可用於識別更爲靈敏和準確的臨牀診斷生物標誌物，預測和監測治療結果，並利用宿主-微生物組的相互作用，以達到有益的目的。
最後，這些技術還需要回答一些新的生物學問題，比如微生物亞羣與宿主之間的合作行爲如何能夠成功地實現從營養吸收到病原體清除的協調結果。此外，在這些反應中，細菌和宿主細胞之間的分工，可能在RNA-seq細胞行爲的體積平均值中丟失，現在可以進一步研究。這裏所審查的技術將促進今後的研究，旨在澄清該領域若干懸而未決的問題，例如:
- 細菌亞羣如何合作以實現種羣水平的優勢增長?
- 宿主細胞亞羣如何協調抗微生物反應，以最大化效率和最小化組織損傷?
- 宿主和微生物方面的細胞亞羣參與的層次是什麼?
回答這些問題可能會使我們有一種新的思路來思考未來如何根據不同的細胞亞羣設計治療方案。
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