Single-Cell RNA Sequencing and Its Combination with Protein and DNA Analyses
scRNAplus||一個通俗的解釋
單細胞時代 || 細胞身份概念的演變
單細胞時代 || 網絡分析應用進展，機遇與挑戰
單細胞時代 || 從衆病之王到希望之光
單細胞時代 || 宿主-微生物組相互作用
單細胞時代|| 單細胞代謝組學之免疫代謝
我們知道單細胞技術體系中最成熟的要數scRNA-seq了，數據分析也基本上是圍繞RNA展開的。在2020年的當下，單細胞數據科學的數據基礎主要有：
- 表達譜：大部分解析異質性的方法都是基於表達譜的，如分羣/註釋/軌跡推斷/功能富集。轉錄調控等
- 比對結果：這裏就有轉錄本的結構信息，可以得到等位基因/轉錄本剪切等情況（當然是技術平臺而定）
- 自定義新的seq技術。單細胞就像一個巧克力盒，大家都在從裏面拿黑巧克力，我們設計一個seq方法可以同時抓到黑白兩種巧克力，這不是很爽嗎？（高階玩法，歡迎臨摹）
我們所說的單細胞時代，狹義地說，是高通量單細胞測序時代，這當然離不開NGS（Next Generation Sequencing）。本文回顧了傳統的單細胞測序技術，如Cel-seq,smart-seq，考察了微流控技術，重要的是，也關注了幾種同時測定多模態的NGS單細胞技術。
考察這些技術的發展和迭代（如smart-seq 1 到 2到3 ），我們直觀的體會是：
- 通量，通量，通量
- 成本，成本，成本
- 效率，效率，效率
技術發展不會停滯，節約成本永遠向前。單細胞技術會帶領一部分傳統實驗室轉向芯片實驗室（Lab-on-a-chip）。chip-based技術配上bioinformatics，生命科學的科研新範式已經在不少實驗室建立起來，而有的人還在觀望。讓觀望的人繼續觀望吧，我們永不停歇。
細胞羣體的異質性對理解複雜的細胞生物學過程提出了重大挑戰。在單細胞水平上對細胞進行分析，特別是單細胞RNA測序(scRNA-seq)，使得全面剖析細胞異質性成爲可能，傳統bulk分析無法獲得如此豐富的生物信息。最近的研究已經將scRNA-seq與基因組或蛋白質組數據結合起來，並且在描述複雜的細胞異質性方面比單獨轉錄組更有價值。隨着生物醫學和臨牀應用對scRNAseq的需求不斷上升，迫切需要對scRNA-seq技術及其潛在的生物醫學應用進行及時和全面的綜述。在這篇綜述中，我們首先通過詳細介紹每一種scRNA-seq技術，包括傳統和微流技術來討論最新的發展狀況。隨之，我們總結了它們的優點和侷限性以及它們在生物醫學上的應用。最後，簡要討論了scRNA-seq技術商業化的進展與挑戰。
單細胞是生物體的基本結構和功能單位。傳統的複雜組織RNA測序通常掩蓋了每個細胞的特異性。不同的細胞通常作用於一個組織或器官的整體功能來承擔特定的角色。因此，在單細胞水平上進行轉錄組分析，對於提高對與生理功能和人類疾病相關的生物學過程複雜性的理解具有重要意義。單細胞rna測序(scRNA-seq)揭示了單個細胞的特異性，因此，解決了bulk分析無法解決的問題。已被應用於發現新的細胞類型，探索發育生物學過程的動力學，識別基因調控機制等。例如，通過scRNA-seq可以分辨不同的細胞亞羣，從而可以表徵細胞羣的異質性。此外，還可以識別罕見細胞類型，爲的疾病診斷和治療提供有價值的見解。因此，強大的scRNA-seq技術的發展在細胞水平上理解組織和器官功能方面具有潛力，這對於促進診斷和治療醫學的進步起着重要的作用。
傳統的scRNA-seq技術最初包括使用口吸液管、微量吸液管或熒光激活細胞分選(FACS)以及手工分離細胞。雖然這些技術可以擴大規模並實現自動化，但它們仍然耗時且困難。微流體技術的最新進展通過將半自動化操作集成到一個更簡單的設備中，爲scRNA-seq開闢了新的途徑。例如，以閥爲基礎的微流體裝置已經被開發出來，利用微閥門捕獲或捕獲反應室中的單個細胞，在那裏細胞被裂解，其mrna被反向轉錄並擴增。與傳統技術相比，微流控技術涉及的操作步驟更少，通量更高。微流體液滴裝置也被引入，用於將單個細胞封裝在含有試劑的小體積液滴中。然後，細胞裂解，分選，準備文庫和測序。具體來說，這些技術提供了幾個優勢:減少了所需試劑和樣品的體積，減少了操作步驟，高分析靈敏度和特異性以及高通量。此外，納米ell技術還具有操作簡單、樣品和試劑體積要求低、能夠檢測細胞表型(如細胞形狀和大小)等優點。這些功能允許用戶調優細胞加載密度、識別細胞或多細胞、確定細胞生存能力，並識別感興趣的細胞，以便更有效地進行下游流程。
關於介紹scRNA-seq技術的綜述文章已經很多了。然而，大多數研究主要關注技術原理、微流控制造或單獨的多組學。到目前爲止，鑑於scRNA-seq技術的進步，迫切需要對scRNA-seq技術及其與基因組和蛋白質組研究的整合進行及時和全面的考察。在這篇綜述中，我們首先討論了該領域的最新發展，詳細介紹了每一種scRNA-seq技術，包括傳統的和當前的微流體技術(圖1)。
傳統scRNA-seq技術
下面我們來逐一介紹。
- Smart-Seq 1 and 2
RNA模板5 '端交換機制(Switching Mechanism at 5′End of RNA Template，Smart-seq)的引入是爲了解決現有技術的侷限性，如有限的通量和跨轉錄本的讀取覆蓋率。簡單地說，人工挑選單細胞並在逆轉錄酶(moloney murine leukemia virus, moloney)中裂解，反應由含oligo(dT)引物啓動。當逆轉錄(RT)到達RNA分子的5 '端時，一些C核苷酸被添加到cDNA的3 '端進行第一條鏈的合成。在模板轉換oligo (TSO)存在的情況下，模板被RT轉換併合成了cDNA的第二鏈。隨後使用聚合酶鏈反應(PCR)擴增全長cDNAs，以獲得幾毫微克的DNA。然後根據Nextera Tn5轉座子協議製備Illumina測序文庫。這項技術極大地提高了轉錄物的覆蓋範圍，增強了單核苷酸多態性的評估或候選生物標記物的鑑定。它對研究罕見細胞的轉錄組態特別有用。
引入Smart-seq 2是爲了應對Smart-seq 1的低收益、覆蓋率和敏感性差的挑戰。它改善了RT、模板轉換和前置擴增過程，以增加單細胞生成的cDNA文庫的長度和產量。用鎖定核酸(LNA)取代tso3 '端，使cDNA產量加倍，由於增加了na - dna鹼基對的熱穩定性，在Smart-seq 1中出現了TSO。甲基供體甜菜鹼的使用和較高濃度的MgCl2顯著提高了cDNA的產量。在RNA變性之前加入脫氧核糖核酸三磷酸(dNTP)可以增加預擴增的cDNA平均長度，這可能是由於RNA-oligo(dT)引物雜交的穩定性。在預擴增過程中使用KAPA HiFi熱啓動DNA聚合酶可以提供良好的擴增效果和更大的cDNA長度(即增大450 nt)。因此，除了提高穩定性外，Smart-seq 2還提高了從單細胞生成的cDNA文庫的長度和產量，以及檢測的覆蓋率、偏倚和準確性。使用微移管耗時的細胞分離過程和細胞數量少則是爲Smart-seq的侷限性。
- SCRB-seq
單細胞RNA條形碼和測序(SCRB-seq)被引入用於分析來自大量細胞的mrna，使用最少的試劑和每個細胞的測序讀數。該方法根據Smart-seq開發，僅使用細胞特異性條形碼和唯一分子標識符(UMI)進行3 '端測序。單細胞通過流式細胞儀被分成384孔板。RT使用由barcodes、UMI和poly(T)引物組成的RT引物進行。合成的cDNA被彙集和擴增用於測序，使用的裂解方法富集3 '結束。SCRB-seq允許深度、全長的轉錄組覆蓋測序，能夠測序約12000個單細胞。與Smart-seq不同的是，這項技術包括使用細胞條形碼，以便更容易地識別來自同一細胞的讀取。然而，對大量單細胞進行測序仍然具有挑戰性。這種方法適用於在異質羣體中發現轉錄組。
- CEL-seq 1 and 2
細胞線性擴增測序表達(Cell Expression by Linear Amplification and Sequencing (CEL-seq) )主要依賴體外轉錄對CDNA的線性擴增。該協議允許條形碼樣本的合用而放大效率。使用微管人工將單細胞轉移到試管中。在每個細胞裂解後，一個尾部的寡核苷酸(dT)被用於初始化從5 '端到3 '端，末端寡核苷酸(dT)的序列爲T7啓動子，細胞條形碼和poly(T)引物。然後合成第二鏈cDNA，生成含有T7啓動子的雙鏈cDNA。將這些cDNAs彙集在一起，啓動體外轉錄反應以實現cDNA的線性擴增。生成的擴增子被片段化到適合測序的大小分佈。這項技術被用於研究早期秀麗隱杆線蟲胚胎細胞，並證明了即使只有細微的生物學差異也可以區分細胞類型的可能性。
本質上，CEL -seq涉及3 '端cDNA覆蓋，比全長cDNA覆蓋提供了一個更敏感和可複製的結果。與Smart-seq相比，cell-seq在早期就添加了條形碼，專門識別每個單細胞。因此，這減少了動手的工作。但該技術只能用於3 '端測序，提供的轉錄組信息比全長轉錄序列少。改進的CEL -seq方法：CEL -seq 2在條形碼上游增加了一個5鹼基對UMI，用於鑑定scRNA-seq[14]的PCR重複物，顯著提高了準確性。利用superscript II雙鏈cDNA合成試劑盒，結合縮短cl -seq引物，顯著提高了RT效率，從而提高了檢測靈敏度。此外，與原始的CEL -seq協議相比，CEL -seq 2多檢測了30%的基因。現成的試劑也被用於生成單細胞轉錄組庫，這使得它們可以被大多數實驗室使用。與Smart-seq不同的是，在cell -seq中使用細胞條形碼可以更好地識別單個細胞。類似於Smart-seq,CEL -seq使用微移液管進行細胞分離，這使得整個過程非常耗時。
- MARS-seq 1 and 2
大規模並行RNA單細胞測序(MARS-seq)是在CELseq協議的基礎上引入的，作爲分析數千個單細胞轉錄組的自動化工作流程，同時最大限度地減少擴增偏差和標記錯誤。通過流式細胞儀，單細胞被分成384個孔板，RT使用T7啓動子、部分Illumina adapter、細胞條形碼和UMI和poly(T)引物。隨後，自動化處理在彙集和標記的材料上進行了三層條形碼(分子、細胞和板層)，這極大地增加了通量和再現性。它可以用於定義細胞類型和細胞狀態，並將這些與詳細的基因組廣泛的轉錄分析聯繫起來。
MARS-seq 2是MARS-seq的一種改進方法，合併索引FACS排序來豐富感興趣的細胞。這一關鍵特徵對於通過scRNA-seq鑑定稀有細胞亞羣至關重要，例如一種獨特的限制阿爾茨海默病發展的小膠質細胞。與MARS-seq相比，優化了實驗流程，如優化RT引物濃度和組成以及在MARS-seq 2中加入RT引物去除步驟，極大地降低了技術細胞間的污染(背景噪聲)。此外，MARS-seq 2使每孔細胞雙峯最小化(0.2%)，使scRNA-seq分析複雜化。這項技術執行FACS需要熟練的工人。然而，由於它的自動化過程，與上述技術相比，它最小化了採樣偏差，簡化了步驟。
- Quartz-seq 1 and 2
Quartz-seq是一種基於均聚物尾礦PCR（homopolymer tailing-based PCR）的簡單而高定量的scRNA-seq方法。除了評估同一類型細胞之間的轉錄組異質性，它還檢測在同一細胞週期階段的細胞之間的轉錄組異質性。由於基於同聚物尾礦的PCR傾向於產生意想不到的副產物，使scRNA-seq分析複雜化，Quartz seq增加了一個RT引物去除步驟，並使用抑制PCR技術來減少副產物的合成。這就消除了複雜的副產品去除方法的需要。通過流式細胞儀將單細胞分列成管狀並裂解。利用含有一個PCR靶區的RT引物，mRNA被逆轉錄爲第一鏈cDNA。未反應的RT引物被外切酶1消化，並在cDNA的3 '端和任何剩餘的RT引物上添加poly(a)尾。利用含有poly (dT)序列的標記引物進行第二鏈cDNA合成，生成的cDNA和副產物均含有整個轉錄組擴增(WTA)接頭序列(標記引物和RT引物序列)。然後dna通過抑制PCR去除副產物，獲得高質量的cDNA用於Illumina測序。Quartz-seq與Kurimoto等人的方法相比，後者需要對單個細胞使用多個PCR管。與Smart-seq相比，Quartz-seq是高度定量的，可以檢測更多的轉錄。
quartz - seq2的一個關鍵特徵是，它能夠以有限的序列分析單細胞轉錄組。通過流式細胞儀將單個細胞分類到384孔板中，使用包含UMI序列和細胞條形碼序列的RT引物進行細胞條形碼編碼。此外，通過優化poly(A)尾段緩衝液和增加第二鏈cDNA合成步驟的升溫條件，提高了poly(A)尾標記策略的效率。quartz - seq2的UMI轉換效率(32%-35%)高於cell-seq 2、SCRB-seq和MARS-seq(7%-22%)，這是允許使用quartz - seq2以最小的成本從有限的序列中檢測更多的轉錄本。類似於MARS-seq，這項技術涉及到需要熟練工人的FACS。
- SUPeR-seq
單細胞通用poly(A)-independent RNA測序(superseq)是一種基於均聚物尾端PCR的scRNA-seq方法，可以對聚腺苷和非聚腺苷的RNA進行測序。環狀RNA是一種非聚腺苷化RNA，通過交替剪接形成，被認爲在microRNA中結合並抑制幾個重要的細胞功能。用口吸液管人工提取單細胞並裂解以釋放聚腺苷化和非聚腺苷化rna。然後，利用固定錨點序列的隨機引物(AnchorX-T15N6)對這兩種rna進行第一鏈cDNA合成。使用摻雜1% ddATP的dATP將poly(A)尾添加到第一站cDNA的3 '端。不同錨定序列的Poly(T)引物
(AnchorY-T24)然後用於合成第二鏈cDNA，這是隨後的PCR使用深度測序前的AnchorY- t24和AnchorY- t15引物。該技術被用於研究環狀rna在哺乳動物早期胚胎髮育中的作用，並證明了其檢測小鼠着牀前胚胎中環狀和聚腺苷化rna的能力。使用口吸管耗時的細胞分離過程和低通量是爲缺點。
- MATQ-seq
與SUPeR seq不同的是， multiple annealing and dC-tailing-based quantitative single-cell RNA-seq (MATQ-seq)採用UMI和barcode對聚腺苷化和非聚腺苷化rna進行測序。將每個單細胞用口管送入PCR管中，裂解以釋放總RNA。非聚腺苷酸RNA和聚腺苷酸RNA通過基於多重退火和環基擴增週期的引物進行第一鏈cDNA合成(MALBAC)，主要含有T、A、G鹼基和MALBAC- dt引物。然後，首先對第一鏈cDNA進行poly(C)尾跡處理，然後使用g富集的MALBAC引物進行第二鏈cDNA合成。隨機引入六聚體UMI序列，在PCR擴增前對第二鏈cDNA進行標記，進行Illumina測序。MATQ-seq證明，與Smartseq 2和SUPeR-seq相比，使用UMI顯著降低了HEK293T轉錄本的3 '端或5 '端偏置。在檢測單個HEK293T細胞中提取的非聚腺苷酸RNA方面，MATQ-seq比Smart-seq 2和SUPeR-seq更敏感。此外，MATQ-seq檢測低丰度基因的能力高於Smart-seq2。總的來說,
MATQ-seq爲檢測相似細胞類型的單細胞之間的轉錄組異質性提供了高精度和敏感性。與SUPeR-seq相似，MATQ-seq使用口移液管進行細胞分離，這使得過程耗時且通量低。
微流控單細胞技術
雖然前面提到的技術可以自動化和規模，以減少分析成本和反應體積，但它們仍然是勞動密集型的。爲此，已經開發了幾種微流體技術，如閥基、液滴和納米晶片的scRNA-seq技術。表中總結了基於微流體的scRNA-seq技術，這些技術允許以低成本的方式對數千個細胞進行測序，下面將詳細討論。
Valve-Based scRNA-seq Technologies
一種分離下游scRNA-seq單細胞的技術是基於閥的技術。以閥爲基礎的技術通常依靠專用的結構來操作，如通道和壓力控制器。它們的性能通常優於傳統的scRNA-seq技術，因爲它們減少了人工處理和移液管造成的變化，從而實現了更高的重現性，從而實現了更高的靈敏度和準確性、更高的通量和更低的交叉污染風險。
- Multilayer Microfluidic Device for scRNA-seq
爲了克服傳統技術的缺點，我們開發了一種集成閥的多層微流控裝置，從單細胞中製備用於scRNA-seq的cDNA，提高了靈敏度和精度(圖3A)。
從培養細胞中獲得單細胞懸浮液，並將其注射到所述入口通道中。捕獲並分選單細胞，進行後續的細胞裂解和RT反應，然後進行芯片外擴增和文庫準備。半自動程序允許一致的操作時間(例如，裝載和混合)，這將技術錯誤最小化，並提高重現性。所有步驟的總反應體積約爲140發熱量L，比常規臺式技術(90發熱量L)低約600倍。然而，該技術的缺點是需要芯片外放大和低吞吐量。這項技術可以識別單個細胞的差異表達基因，這爲以敏感和精確的方式測量細胞羣體的生物變異提供了巨大的希望。
- . Microfluidic Hydrodynamic Trap Array for scRNA-seq
開發了一種微流體動力阱陣列，可在培養條件控制下，通過多代譜系跟蹤，對單細胞進行芯片外轉錄組測序。這個陣列由20個陷阱組成。通過閥門對壓力進行獨立控制，使連續灌注能夠長期生長，並使單細胞從裝置中釋放出來。將單個細胞裝載到trap陣列的每個泳道中，孵育72 h以促進細胞增殖。一旦細胞增殖，子代被傳遞並被隨後的陷阱捕獲。整個過程經過時移成像，這允許增殖動力學的確定和譜系跟蹤。根據Smart-seq 2協議對細胞進行測序，Smart-seq 2協議將轉錄測量與譜系信息聯繫起來。長時間培養的生長動力學是穩定的，倍增時間一致，這表明該裝置不會干擾[的長期細胞增殖。這項技術提供了在單細胞分辨率研究多代發育的潛力，這對癌症、免疫學和發育生物學領域很重要。
- MID-RNA-seq
採用微流控擴散基RNA-seq (MID-RNA-seq)進行擴散基試劑交換方案的scRNAseq(圖3B)。該裝置包括細胞捕獲、裂解、RT和PCR擴增，並通過氣動微閥控制流體流量。該技術利用濃度梯度驅動擴散的優勢，將試劑輸送到反應室，同時消除了之前步驟中的試劑。
通過樣品入口將單細胞懸浮液引入裝置。通過操作閥門，單個細胞被困在腔室中。用磷酸鹽緩衝鹽(PBS)和裂解緩衝液沖洗。裂解緩衝液擴散，將被捕獲的細胞移至反應室進行裂解反應。採用相似的擴散過程進行RT和PCR，洗脫緩衝液洗滌後收集cDNA進行文庫製備和測序。然而，與大多數傳統技術不同的是，它支持自動化處理和多路複用。該技術的結果與傳統的scRNA-seq技術相當。與上述基於閥的微流體技術一樣，該技術需要複雜的器件製造工藝。
- Hydro-seq
引入水動力scRNA-seq (Hydro-seq)是爲了解決現有的scRNA-seq技術帶來的低吞吐量和電池捕獲效率低下的挑戰(圖)3 c)。Hydro-seq利用基於大小的單細胞捕獲方案捕獲罕見細胞，如循環腫瘤細胞(CTCs)，實現了>70%的細胞捕獲效率。
一旦樣品加載完畢，捕獲閥就關閉，細胞就會隨着珠一起流過捕獲點，靶細胞就在捕獲點被捕獲在腔內。注射裂解緩衝液，關閉腔內所有閥門。細胞被裂解，其mrna被珠捕獲。然後通過打開所有閥門並引入下游scRNA-seq的迴流來回收珠子。該腔可擴大到數千個，用於大規模平行富集和稀有細胞的分析。與其他技術相比，該技術提高了小區捕獲效率和通量。hydro-seq的效用通過對CTCs進行測序和確定腫瘤生物標記物的轉錄組異質性得到證實，以瞭解轉移過程和監測癌症患者的靶向治療。
Droplet-Based scRNA-seq Technologies
介紹了液滴微流控技術，主要涉及將單細胞封裝在惰性載體油中的液滴中。載體油的使用使液滴能夠移動、合併、分離、加熱或存儲。這些技術速度快通量大。此外，可以在幾秒鐘內對數千個細胞進行分選，這對於大型應用程序非常理想。
- Hi-SCL
爲scRNA-seq開發的第一個基於液滴的微流體技術是高通量單細胞標記(Hi-SCL)。該技術將單個細胞封裝在液滴中，大大降低了每個細胞的封閉體積，特別是與傳統納米技術中常用的微升體積相比。然後，每個液滴與另一個包含裂解緩衝液、RT緩衝液和DNA條形碼的液滴融合，這些DNA條形碼可以唯一地標記單細胞轉錄組。液滴隨後被放大並測序。乳劑中液滴之間的低污染風險通過混合人類和小鼠細胞得到證明，這表明大多數讀取來自每個獨特的物種。這項技術被用於測量來自小鼠胚胎成纖維細胞和小鼠胚胎幹細胞的數百個細胞的RNA水平。從本質上說，儘管這項技術的電池捕獲效率很低，但它使條形碼成爲可能，並增加了篩選更多電池的能力。這顯示出了一種潛力，可以極大地擴展微流體的能力，以高通量的方式表徵單細胞。
- In-Drop
與Hi-SCL相似，分度液滴(in - drop)的反應在液滴中進行，允許對數千個細胞進行RNA-seq(圖4A)的分度。微流控裝置由四個輸入載體油、細胞、裂解液或RT試劑的入口，一個攜帶條形碼引物的水凝膠微球和一個收集液滴的出口組成。水凝膠微球通過光釋放鍵與細胞條形碼共價連接。
每個條碼由一個細胞條碼、一個UMI、一個Illumina測序引物、一個T7 RNA聚合酶啓動子和一個oligo(dT)尾巴組成。細胞封裝後，細胞被裂解，通過暴露於紫外光下，條形碼從微球中釋放出來。在RT過程中，每個液滴的cDNA都被標記上條形碼，然後根據cell -seq協議進行擴增和測序。該方法被優化以最大限度地降低包封雙晶和產生的風險90%的液滴包含一個細胞和一個微球。這項技術使大量細胞的scRNA-seq成爲可能，這使得從異質羣體中識別非常罕見的細胞類型成爲可能。與上述技術相比，In-Drop技術採用水凝膠微球引入寡核苷酸。在液滴中進行裂解和RT，以簡化操作過程。然而，In-Drop的主要缺點是極低的細胞捕獲效率(~7%)，只能檢測到每個細胞的20-50拷貝轉錄。
- . Drop-seq
Drop-seq與In-Drop有一些相似之處，In-Drop也包括一個用條形碼封裝每個單細胞的液滴(圖4B)。與使用條形碼水凝膠的In-Drop不同39個微球中的21個，這項技術使用條形碼微球。珠上的寡核苷酸包括用於擴增的手柄序列、識別單個細胞中所有寡核苷酸的細胞條形碼、UMI和捕獲單細胞mRNA分子的寡核苷酸(dT)序列。
細胞被分離成小滴後被裂解，mRNA分子的多聚(A)尾與小珠上的寡聚(dT)尾雜交，形成單細胞轉錄組附着在其上微粒子((STAMPs)。然後液滴被打碎，並在單管中接受RT。隨後使用Nextera XT試劑盒進行PCR和片段化。與前面提到的技術相比，該技術以更便宜和更快的方式實現了高吞吐量分析(每天約10,000個單細胞庫)。細胞捕獲效率約爲12.8%，高於In-Drop法。然而，與In-Drop類似，只能使用3 ' most末端片段進行測序。
- 10x Genomics
如上所述，基於水滴的技術支持同時快速處理數千個單元，但是目前的技術具有中等吞吐量，這需要使用定製的試劑(圖4C)。爲了克服這些缺點，一種基於水滴的技術，即10x基因組公司開發的這項技術能夠對數千個單細胞中的3 '信使RNA (mRNA)進行數字計數。
乳狀液中的凝膠珠(GEM)是這項技術的核心，它集成到基於水滴的微流體裝置中，能有效捕獲大約50%的負載細胞。每個凝膠珠均由條形碼寡核苷酸功能化，寡核苷酸由illumina適配器、10倍條形碼、UMI和寡核苷酸(dT)組成，寡核苷酸可引導聚腺苷化rna的RT。細胞包封后立即開始細胞裂解。然後凝膠珠溶解並釋放出用於RT的寡核苷酸。RT在液滴內進行，並轉移到發生cDNAs擴增的試管中。帶有Illumina適配器和樣本索引的擴增子允許同時彙集和測序多個庫。測序數據可以通過分析管道快速處理。利用該技術對68k外周血單核細胞(PBMCs)進行了剖切，顯示了其對大免疫羣體[54]的剖切能力。與in - drop類似，10x genomics使用凝膠珠引入寡核苷酸，裂解和RT都在滴中進行。極大地簡化了整個細胞裂解至pcr的處理時間(<10 h)。與現有的基於水滴的技術相比，該技術引入的10x條形碼大大提高了通量。這使得可以爲scRNA-seq並行處理數千個cell。與In-drop和Drop-seq相似，只有3 ' most末端片段可以用於測序。
- MULTI-seq
使用脂質標記指標進行單細胞RNA測序(MULTI-seq)的多路複用技術允許將DNA條形碼定位到乳狀液液滴中的單個細胞中進行scRNA-seq測序。單細胞首先通過一對脂質修飾的寡核苷酸(LMO)雜交標記，分別與5 '木質素酸酰胺和3 '棕櫚酸酰胺結合到細胞膜上。該LMO包括一個5 ' PCR、一個8-bp DNA條形碼和一個3 ' poly(a)捕獲序列。使用10x Genomics Chromium系統，每個單細胞攜帶封裝的LMOs和一個mRNA捕獲珠到乳劑液滴中，隨後細胞裂解釋放RNA和LMOs。細胞mRNA和LMOs都與mRNA捕獲珠雜交，然後在RT期間連接到一個共同的細胞條形碼，這允許樣本多路複用。擴增後，LMO片段通過大小選擇從mRNA中分離出來，然後進行下一代測序(NGS)文庫準備。這種技術被用於在不同轉移進展階段從病人來源的異種移植小鼠模型中分離出的冷凍保存的肺和原發性乳腺腫瘤。通過揭示幾種免疫細胞對乳腺腫瘤肺轉移的反應，MULTI seq的效用被成功證明。由於每個單細胞都用多個指數標記，MULTI-seq能夠容易地識別和去除細胞雙態，並提高設備的通量。該技術的一個缺點是隻能使用3 ' most末端片段進行測序。
Nanowell-Based scRNA-seq Technologies
最近，納米維爾技術被開發出來，與基於水滴的設備相比，納米空技術在單細胞分析方面有幾個優點，包括細胞加載週期短、試劑和樣品體積低、與光學成像的兼容性增強。執行光學成像的能力允許用戶通過在庫準備之前提供更多的細胞信息來檢查和調整細胞裝載密度、識別多胞胎和確定細胞生存能力。下面幾節將簡要討論這些技術。
- Cytoseq
基因表達細胞儀(Cytoseq)可以對含有珠子的納米細胞中的單細胞RNA進行大規模並行隨機條碼編碼，從而可以同時對數千個單細胞進行基因表達譜分析。將細胞加入納米管中，顯微鏡下觀察。將小珠裝上以飽和所有孔，並加入新鮮的裂解緩衝液。通過在納米管陣列上放置一塊磁鐵，這些帶有捕獲到的mrna的珠子就會被回收。在進行擴增和測序之前，使用上標II或III進行cDNA合成。與Drop-seq類似，細胞中的所有mRNA分子都用獨特的細胞條形碼進行標記，每個轉錄本都用UMI進行索引，這使得mRNA轉錄本能夠被數字化計數。Cytoseq的效用通過鑑定罕見細胞和描述免疫反應中的細胞異質性得到證實。儘管這種技術不是完全自動化的，但它使簡單的製造過程和高通量分析成爲可能。這項技術將有助於更好地瞭解複雜生物系統的細胞多樣性，爲未來的臨牀應用。
- Microwell-seq
爲了對細胞羣進行更全面的轉錄組分析，microwell-seq使用瓊脂糖構建的納米管來分析數千個單細胞(圖5A)。硅微陣列用於構建微柱聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片，隨後用於創建瓊脂糖納米晶陣列。與Cytoseq一樣，每個磁珠都被裝入孔中，在捕獲單細胞mrna後由磁鐵回收。RT、擴增和文庫製備均遵循smart - seq2協議。“小鼠細胞圖譜”由來自51只小鼠組織、器官和細胞的400k單細胞轉錄組譜構建，涵蓋了小鼠系統中800多種主要細胞型和1000多種細胞亞型。
與Cytoseq不同的是，該技術能夠在採樣處理之前的成像基礎上去除細胞雙極體，從而產生更高質量的數據。像其他Nanowell技術，這項技術不是完全自動化的。未來的工作將進一步簡化操作過程，並整合數據來創建一個全面的哺乳動物細胞圖譜，這將有助於科學研究和臨牀應用。
- Seq-well
最近，Seq-well被開發出來，它利用納米管陣列的優勢來實現大規模並行scRNA-seq(圖5B)。在玻片上製備了薄層PDMS納米管。芯片上進行細胞裂解和RT。Seq-well的一個主要優點是使用了半滲透的聚碳酸酯膜(10納米孔徑)，該膜可以可逆地附着在Seq-well上
通過選擇性化學功能化的納米管。這一特性允許快速的溶液交換裂解單細胞和捕獲生物大分子，以減少交叉污染，實現高效捕獲mrna。
該陣列的三層功能化表面由氨基硅烷鹼基通過對苯二異硫氰酸中間體與雙功能聚(穀氨酸)殼聚糖交聯而成。在陣列的頂表面的殼聚糖允許有效的封閉膜，而聚(穀氨酸)在陣列的內表面抑制非特異性mRNA結合。細胞裂解後，將陣列轉移到新的皿中並倒置，使PDMS表面與皿中接觸，以便離心後收集小珠。庫的準備是基於Drop-seq協議。該技術被用於對暴露於結核分枝桿菌的數千個原發人巨噬細胞進行測序。它能夠處理小數量的樣本，並與陣列成象細胞儀兼容，用於從複雜的生物樣本中識別細胞表型。
- SCOPE-seq
單細胞光學表型和表達測序(SCOPE-seq)被開發出來，它能夠基於每個細胞的表型特徵來識別它們，並將表型信息與scRNA-seq數據鏈接起來(圖5C)。使用光學解碼或雙條形碼珠，由Drop-seq珠產生，通過在分裂池結紮的兩個循環中從一組12個寡核苷酸中選擇唯一的組合來連接寡核苷酸。利用光學條形碼，樣品的身份被連接到一個測量，允許每一個光學解碼珠被序列熒光雜交解碼。小珠與寡核苷酸結合，寡核苷酸由細胞條形碼、UMI和用於文庫準備和RNA測序的3 ' -poly(dT)序列組成。微珠和細胞隨機分佈在PDMS納米細胞陣列中，一旦微珠捕獲到單細胞mRNA，納米細胞陣列就被切割成多個片段。然後提取珠進行文庫準備。最後，對圖像進行處理，以識別每個珠子上的光學條形碼，並識別相應的條形碼，將單個細胞顯微鏡數據，如細胞活力、多重檢測、細胞/細胞核大小和形態、表面標記蛋白表達水平、細胞信號動力學和行爲與RNA-seq數據相連接。和Seq-well一樣，這項技術也包括用全氟油密封納米管，以減少井間的污染，而且它不是完全自動化的。在未來，微珠可以大規模製備，這使其成爲將高通量顯微圖像與測序數據相關聯的強大技術。
- scFTD-seq
爲了進一步簡化步驟，單細胞凍融裂解直接針對3 ' mRNA測序(scFTD-seq)的微芯片被開發用於執行scRNA-seq使用細胞經過凍融溶解。與前面提到的技術相似，該技術使用了PDMS Nanowell。將細胞和微珠裝入納米管陣列，並引入弱裂解緩衝液。對於封閉的納米套管，使用玻璃載玻片仔細密封陣列，而對於開放的納米套管，使用氟化油作爲密封劑以減少交叉污染。將凍融裂解法應用於每個含珠納米細胞中，捕獲mrna進行轉錄組測序。與Seq-well方法類似，陣列被轉移到一個倒置方向充滿PBS的孔板上，離心將微珠釋放到PBS溶液中。然後將溶液轉移到離心管中，進行下游的RT過程。所述凍融溶解消除了通常需要複雜微流體裝置的自動化流體交換的要求。由於在凍融裂解緩衝液中沒有活性裂解成分，該技術不會立即啓動裂解，從而最大限度地減少交叉污染。它兼容開放環境或封閉環境的細胞裝載配置，這使得它非常適合應用在護理點設置和集中實驗室。
scRNA-seq與蛋白質組分析的結合
如前所述，高通量scRNA-seq方法已被證明對描述複雜細胞羣是有價值的。然而，現有的方法不能提供蛋白質組學信息，如細胞表面蛋白的表達。配對RNA和蛋白質分析揭示了基因表達和細胞表型的信息，提供了更詳細的細胞亞羣分類。一些特殊的生物信息學軟件(例如，Cite-seq count)已經被引入來對原始測序reads中的UMI或antibois標記的寡核苷酸進行計數。爲了同時測量轉錄組和細胞蛋白，並從單個細胞產生高效讀出，已經開發了幾種微流控技術。這些技術被總結在表3和下面幾節將對此進行描述。
- Cite-seq
通過測序對轉錄組和表位進行細胞標引(Cite-seq)，在單細胞水平上同時分析轉錄組和細胞表面蛋白丰度。該方法通過鏈黴親和素-生物素相互作用將寡核苷酸的5 '端連接到抗體上。這些抗體是鏈黴親和素標記的，而帶有5 '胺修飾的DNA寡核苷酸使用nhs化學進行生物素化。這一過程導致二硫鍵的形成，在還原條件下將寡核苷酸與抗體分離。通過加入50 mM的二硫蘇糖醇(DTT)緩衝液，可以裂解附着在寡核苷酸上的生物素間隔臂上的二硫鍵，從而產生高純度的dna，單細胞被分選和裂解。mRNA和抗體標記的寡核苷酸與磁珠上的寡核苷酸(dT)引物結合。抗體標記的寡核苷酸含有用於識別的條形碼和用於PCR擴增的手柄。按照Drop-seq協議執行ScRNA-seq。該方法允許同時檢測大約13種表面蛋白和轉錄本。
- Reap-seq
與Cite-seq相似，RNA表達和蛋白測序(Reap-seq)可以在單細胞分辨率下並行定量mrna和蛋白(圖6B)。它能檢測大約82種抗體和超過20,000種基因。這兩種方法在DNA條形碼與抗體結合的方式上有所不同。與Cite-seq不同，repe -seq利用單向化學，在氨基化DNA條形碼和抗體之間產生穩定的小共價鍵，從而減少空間位阻和潛在的串擾。在高通量蛋白質分析中，最大限度地減少空間位阻是非常重要的，並且在未來將這種方法擴展到細胞內標記。這種方法很容易適用於現有的scRNA-seq平臺，該平臺比單獨測量轉錄組更詳細地評估了轉錄組和細胞表型。
Cite-seq和Reap-seq都使用了類似的方法，生成一個蛋白質讀數並與單個細胞轉錄組一起進行測序。與流式細胞術檢測細胞表面蛋白不同，這些技術使用DNA條形碼來標記表面抗體。DNA條形碼技術通過在單個測定中靶向不同的表位，使多種抗體的結合成爲可能，這些表位可以通過測序來解決。這項研究對單細胞進行了更全面的分析，從而可以很好地區分細胞類型。它還可能被用於探索轉錄後基因調控。到目前爲止，將技術擴展到檢測細胞內蛋白和轉錄組仍然是一個挑戰，特別是由於細胞通透性的要求，這可能會導致RNA降解。
- PDMS Nanowell and seq
爲了檢測同一細胞的轉錄組和分泌組，一項研究開發了PDMSNanowell技術來研究細胞因子的分泌，然後進行下游轉錄組分析。PDMS被膠原包覆並裝載單細胞。整個裝置隨後用抗體陣列密封，抗體陣列捕獲單細胞分泌的細胞因子。使用32G注射器挑出具有理想分泌狀況(即高腫瘤壞死因子(TNF)-分泌物)的單細胞進行後續RNA測序。過轉錄組分析，在小鼠巨噬細胞中發現了一組與TNF- a分泌相關的高共表達基因。這項技術可能使人們對免疫調節機制有更深入的瞭解，這爲藥物發現和醫學治療帶來了巨大的希望。
scRNA-seq與DNA分析的結合
現有的scRNA-seq方法不能提供基因型信息，如gDNA拷貝數、染色體結構和數量。事實上，配對轉錄組和DNA分析揭示了DNA結構和拷貝數的變化對基因表達的影響。這將直接將細胞基因型(野生型或突變型)與其功能狀態(細胞類型和狀態)聯繫起來。例如，直接影響下游基因表達和調節轉移的腫瘤驅動基因可以通過轉錄組學和DNA分析來識別。這種綜合分析將增強我們對異質健康和疾病組織的羣體結構和細胞特性的理解。目前的研究分別分析轉錄組和基因組數據。例如，在一項研究中，NODES算法和基因組分析工具包變體調用管道分別用於分析scRNA-seq和scDNA-seq數據。
爲了將DNA分析和轉錄組測量集成到一個高效的單細胞反應中，已經開發了幾種技術，如下所述。表4總結了這些技術。
- . DR-seq
gDNA-mRNA測序(DR-Seq)允許使用準線性擴增策略對同一單細胞同時進行轉錄和DNA分析，而無需將mRNA與gDNA進行物理分離(圖7A)。用口吸液管挑取單個細胞，放入PCR管中。細胞裂解釋放RNA和gDNA。使用適配器1-x (Ad-1x)和具有細胞特異性條形碼的多t引物(5 ' Illumina適配器和T7啓動子懸置)，mRNA被反向轉錄爲單鏈cDNA。然後，使用adaptor-2對cDNA和gDNA進行準線性全基因組擴增(WGA)，已知adaptor-2在5 '端有一個確定的27-nt序列，後面跟着8個隨機核苷酸。隨着擴增過程的進行，大多數擴增子的兩端都有AD-2。少量由cdna衍生的擴增子，其中一端爲Ad-2，另一端爲Ad-1x。一半的樣品受PCR，隨後去除Ad-2，並製備細胞特異性指標性Illumina文庫，用於gDNA測序。另一半轉化爲雙鏈cDNA，然後利用體外轉錄進行擴增，製備NGS RNA文庫進行轉錄分析。DR-Seq被發現與現有的scRNA-seq方法一樣有效，包括CEL-seq MALBAC。此外，DR-seq結果顯示，單個癌細胞間基因表達的變異可能與gDNA拷貝數變異有關。
因此,DR-seq可用於確定病變組織和健康組織中gDNA拷貝數變化的轉錄後果。由於mRNA和DNA的擴增不需要物理分離，故DR-seq在分析時需要對編碼序列進行硅屏蔽，以確定gDNA拷貝數的變化。
- G and T-seq
與DR-seq相似，基因組和轉錄組測序(G和T-seq)可以同時進行單細胞DNA和轉錄組分析，以評估遺傳變異對基因表達的影響。單個細胞可以通過流式細胞儀或手動的微移液器分離出來，然後放入96孔板的井中。細胞裂解釋放RNA和gDNA，然後使用鏈黴親和素磁珠功能化的生物素化寡聚物(dT)從gDNA中分離mRNA。mRNA與微珠結合後，在平板下方放置磁鐵捕獲微珠，以便收集含有gDNA的上清液。在轉錄組測序之前，mRNA受到on-bead WTA的作用，而gDNA受到WGA先於基因組測序。研究發現，G和T-seq能夠指示單個細胞內染色體異常(如染色體間融合和染色體非整倍體)的轉錄後果。因此，G和T-seq可以幫助建立細胞間變異在疾病和正常發育過程中的染色體結構和數目的功能。與r -seq相比，G和T-seq不需要對編碼序列進行硅掩模來識別基因組複製數變異，從而簡化了數據分析過程。
- SIDR-seq
除上述技術外，gDNA與總RNA的同時分離與平行測序(SIDR-seq)也被引入到gDNA與RNA的同時序列中(圖7B)。bulk細胞首先與細胞特異性抗體結合的磁性微珠結合，然後將珠子標記的單細胞分選到48孔微板的孔中。低滲溶液被用來破壞一個細胞的質膜釋放所有的細胞質RNA，而gDNA仍留在細胞核內。然後在培養皿下放置一塊磁鐵，以捕獲帶有珠子標記的單細胞，將RNA從gDNA中分離出來，從而收集含有總RNA的上清液。mRNA被反向轉錄並受到WTA在轉錄組測序之前，而gDNA在基因組測序之前經過WGA。與DR-seq、G和T-seq相比，SIDR-seq具有一些優勢。首先，SIDR-seq在分析識別遺傳變異時不需要對編碼序列進行硅掩蔽。第二，SIDR-seq可以從物理上分離gDNA中的所有rna，包括mRNA和非編碼rnaRNA(特別是長非編碼RNA)，它允許收集長非編碼RNA用於癌症診斷的潛在應用。此外，SIDR-seq比對比對率高於DR-seq或nuclear -seq(單細胞基因組測序方法)，重複比對率低於DR-seq。這項技術可以應用於更全面的研究細胞的異質性和複雜性。
- CORTAD-seq
同步測序轉錄組和目標基因組區域(cortado -seq)，可以在自動化的高通量微流控平臺(Fluidigm C1)上同時評估同一單細胞內的轉錄組和基因組。Fluidigm C1可以捕獲和處理多達96個單細胞用於gDNA和mRNA測序。單細胞裂解釋放RNA和gDNA，然後mRNA轉化爲cDNA。然後使用特異性引物對gDNA和cDNA進行PCR。在基因組測序之前，利用基因分型引物對一半樣本進行另一輪PCR擴增gDNA，同時減少cDNA的數量。另一半直接用於轉錄組測序。cortadi -seq顯示，發生T790M突變的肺癌細胞的轉錄組與發生T790M野生型肺癌細胞的轉錄組略有不同。因此，它可以用於研究已知的靶向基因突變在各類癌症中的轉錄組分析。由於需要已知目標序列，因此該技術不適用於全基因組DNA分析以發現爲目的。
- . scTrio-seq
除了基因組和轉錄組測序，單細胞三組測序(scTrio-seq)也分析來自同一細胞的表觀基因組或DNA甲基(圖7C)。有報道稱表觀基因組學在調控單細胞基因表達中起着重要作用[71]。首先使用口吸管將單個細胞轉移到PCR管中，裂解僅釋放mRNA。離心後，mRNA與含DNA的完整細胞核物理分離，收集含mRNA的上清液進行RT和cDNA擴增
(Smart-seq或cell -seq)在轉錄組測序之前。裂解完整的細胞核，將釋放的gDNA分別進行WGA和亞硫酸氫鹽轉換進行基因組測序和DNA甲基組測序。scTrio-seq結果表明，啓動子處的DNA甲基化可下調單細胞基因表達，基因體處的DNA甲基化可上調單細胞基因表達。根據每個單個癌細胞的多組學信息，可以識別出不同的癌細胞亞羣，並確定亞羣的惡性程度和轉移潛力。總之，scTrio-seq可用於確定細胞羣體特別是癌細胞中基因組和表觀基因組異質性的轉錄後果。
商業化的單細胞轉錄組技術
到目前爲止，有一些商用的scRNA-seq樣品製備技術，包括基於液滴的和基於納米線的技術(表1)。基於滴落的技術，如chromium system (10x genomics)(圖8A)[54]和in-Drop system (1CellBio)，已啓用高通量單細胞分析(> 10000細胞)，並擁有密集的用戶支持。
這些技術雖然比較先進，但也存在着一些侷限性，如液滴脆性、泄漏風險、捕獲效率低等問題，特別是在初始密度較低的情況下。否則，較高的初始細胞濃度會增加每個液滴中含有雙態粒子或堵塞系統的機率。
Nanowell-based技術擁有數千個納米管，每個納米管都由單個與寡核苷酸偶聯的微珠組成，可以捕獲目標mrna，從而實現高通量分析。裂解前觀察陣列，記錄珠數、細胞數、細胞偶線數、空孔數等信息。可以優化珠和細胞的數量，以獲得最大的測序效率。與基於水滴的技術不同，它們對用戶友好，未經訓練的用戶很容易操作。它們還能處理少量的細胞，比如稀有細胞。此外，他們中的大多數可以進行基於細胞特徵，表面標記，或形態學的細胞選擇。
爲了便於分離用於下游工藝的單細胞，引入了穿孔平臺(Vycap)。這種技術的主要優點是能夠分離出罕見的單細胞(例如，循環腫瘤細胞)來自真實樣本。樣品通過細胞隔離芯片進行過濾，該芯片由6000多個納米孔組成，只有一個微孔。爲了讓細胞懸浮液流過微孔，應用低壓在幾分鐘內將單個細胞分類成單個孔。後在每口包含單個細胞的井的底部打孔
，用穿孔針和收集到微板或管。這項技術已經成功地收集了超過95%的選定細胞，這些細胞可以潛在地用於各種scRNA-seq應用。
結論
總之，最近的scRNA-seq技術的發展，如基於閥的、基於水滴的和基於納米線的scRNA-seq技術使得對單個細胞的高靈敏度、高精度和高通量轉錄組分析成爲可能。結合單細胞轉錄組數據和蛋白質組數據，可以理解轉錄組細胞狀態如何轉化爲功能表型狀態。此外，由於異質性可能在轉錄後和翻譯後過程中都存在，它可能揭示出僅從scRNA-seq數據無法獲得的表型細胞狀態。整合轉錄數據和基因組數據，允許檢測基因突變與轉錄組。這種整合可以深入瞭解癌症的演變，並幫助解決單靠RNA測序無法解決的醫學難題，如解剖複雜的細胞免疫反應或確定腫瘤內的異質性。
未來研究的一個領域將是提高現有技術的效率，包括靈敏度、多路複用、吞吐量和成本效益。具體來說，考慮到分析更多細胞的需求，消耗品、勞動力和測序的成本仍然很高，這對大多數scRNA-seq技術的廣泛實施構成了障礙。因此，降低總成本可能是關鍵的一步。開發具有高樣品處理能力和低反應量的高通量技術(例如液滴或納米技術)以及易於製造和操作的工藝可以以最小的成本實現高效的scRNA-seq。儀器的自動化將減少檢測時間，減少人工干預。這將減少操作偏差，提高不同實驗室的重現性。在達到上述標準的同時，測定靈敏度不應受到影響。此外，目前的技術依賴於polyT啓動，因此，只有聚腺苷化mrna被測序，這可能沒有信息。對長鏈非編碼RNA等非聚腺苷基RNA進行測序，對更好地理解基因調控和基因表達異質性具有重要意義。因此，這將有助於發展技術，允許測序這些分子，以提高效率和質量的scRNA-seq。
多組學的進一步發展將使我們對細胞類型和細胞狀態有更全面的認識。例如，DNA測序和DNA甲基化可以通過長讀測序與轉錄組一起檢測，以獲得更多的細胞信息。同時，應該創建專業的多組算法來同時分析不同層次的數據。與scRNA-seq集成的空間信息高分辨率捕獲應擴展到包括抗體標籤或其他核酸標籤。此外，livecell成像數據與scRNAseq數據的更大的聯繫可能允許對更復雜的表型進行測量。例如,細胞成像之前測序可以提供細胞表型信息(例如,細胞大小、形態和表面標記)和動態(如細胞生長增殖、分化、遷移、和信息交互),然後可以與相同的細胞的轉錄組通過提供更多的信息輸出。將3D水凝膠(如聚乙二醇雙丙烯酸酯或甲基丙烯酰明膠)納入技術可以更好地理解體內單細胞反應。此外，使用組合索引或光學解碼珠可以連接活細胞顯微鏡分析scRNA-seq以及檢測多聯體。更重要的是，需要一種用於下游分析的精確和簡便的細胞檢索技術。
除了技術進步之外，計算分析方法也在進步。關於scRNA-seq生物信息學的綜述文章來源廣泛且容易獲得。分析scRNA-seq數據的挑戰之一是由於初始細胞濃度低或轉錄檢測效率低而帶來的技術噪聲，從而導致不同細胞測序效率的差異。噪聲源可以用插入式RNA標準來建模。確定細胞亞羣的庫和它們之間的各種基因是具有挑戰性的。因此，建議選擇與特定組織生物信息相關的已知轉錄因子或基因子集。還建議使用聚類算法(如層次聚類、K-means聚類)來根據這些基因在不同細胞中的表達來識別特定的細胞類型。
此外，未來的工作應該包括在短時間內生成兩個或多個數量級的大數據，以產生更多的單細胞信息。我們預計，在未來，更多的研究將專注於發展強大的scRNA-seq技術，這將有助於解開單個細胞在各種人類疾病中的功能，並顯示出巨大的前景，在生物學和臨牀應用。