一、污水中病毒組
最近在看一些病毒宏基因組的論文。前幾篇可能看得認真和全面一點，寫得也會多，後面的論文方法什麼的應該大同小異，就只總結流程圖和“小異”。
1.大致內容流程圖
2.方法和結果
（1）viral particles：收集的污水樣品保存在-80℃。使用前，600-800ml污水樣品在4℃解凍72h→4℃，4000g，15min離心（留上清）→4℃，10000g，15min離心（留上清）→採用0.22μm孔徑的切向流過濾（tangential-flow filtration）裝置收集病毒組分→用30-kDa的切向流過濾器濃縮病毒溶液至12ml→鏡檢（SYBR gold epifluorescence microscopy）。
（2）Viral nucleic acid：鏡檢有病毒粒子→採用超高速離心加蔗糖層（38%，wt/vol）的方法得到病毒沉澱→重懸在500μl SM buffer（100mMNaCl，8mMMgSO4·7H2O，50mMTris-HCl，pH 7.5）中→用DNase和RNase消化遊離的核酸→最後用試劑盒提取病毒的核酸。
（3）construct libraries：文中每個樣品都用了12對random primers做了RT和cDNA RT-PCR→樣品不同的PCR產物定量至相同的量→454 GS FLX titanium平臺測序。
（4）Bioinformatics：根據引物tags對得到的reads進行修剪和解析，對於每個樣品，若reads間有超過35bp且一致性超過95%的，會被assembled到同一個contigs→大於100bp的reads、assembled contigs和nonassembled singlets在GenBank-nonredundant nucleotide and protein sequence databases中進行比對（BLASTn和BLASTx），E value<10^-4→根據BLAST返回的結果將序列分類→解析序列與BLAST返回結果的一致性分佈（sequence identity distribution analysis，下圖）。
四個樣品包含的病毒種類和佔比
一致性分佈，每個點是一個BLAST中的查詢序列
（5）Acquisition of novel virus genomes：用試劑盒提取病毒粒子的核酸→病毒基因組序列的3’和5’端用RACE試劑盒擴增，中間序列根據454的測序結果設計引物，用sanger測序驗證。
對於環狀DNA基因組，使用“rolling-circle+inverse PCR amplification”，我在前面的推送裏寫過inverse PCR：【現學現賣】實驗-PCR。首先用試劑盒rolling- circle amplification（Genomiphi; GE Healthcare）和random hexamers擴增核酸樣品中的環狀DNA基因組→用inverse PCR擴增全長，sanger測序。
（6）Phylogenetic analysis：選取可能的新病毒和它們在BLAST中相近的hits，以及與相近科、屬病毒的氨基酸序列→MUSCLE和MAFFT進行多序列比對，選取比對好的進行→pairwise distance analyses和conserved amino acid analyses，之後進行→Maximum likelihood tree（RAxML預測參數，PROTGAMMA，Dayhoff similarity matrix parameters，用MEGA-midpoint rooting美化了無根樹）和Sliding-window analyses。
圖片中A是兩個新病毒，B和C是用序列中兩個片段分別建樹的結果。
有的新病毒和已知病毒的親緣關係較遠
與其他病毒親緣關係較遠的病毒，B是sliding-window分析的aa序列一致性
（7）Nucleotide composition analysis (NCA)：判斷新發現的病毒的宿主。因爲這個是研究生活污水的，所以要看病毒羣體和新病毒的寄主是什麼。
文章結構清晰，結果討論部分充分分析了材料中包含的已知病毒種類和寄主的分佈情況，以及實驗中發現的新病毒的可能種類和可能寄主，並且結合NCA結果，討論進化樹中分支的可能原因等。