新一代位點特異性基因組工程學利器——TALEN、ZFN以及CRISPR/Cas ...
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前言 轉錄激活樣效應因子核酸酶（transcription activator-like effector nuclease, TALEN）技術與鋅指核酸酶（Zinc-finger nuclease, ZFN）技術組成了一大類強有力的基因組編輯工具，這一大類技術的發展重新劃定了生物學研究的邊界。這些嵌合核酸酶由兩部分組成——一個可編碼的序列特異性DNA結合模塊與一個非特異性的DNA切割結構域。通過誘導DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand break）來刺激容易出錯的非同源末端連接或在特定基因所在的位置進行的同源定向修復，TALEN和ZFN能夠完成一系列遺傳學編輯修飾操作。 成簇規律間隔短迴文重複（clustered regulatoryinterspaced short palindromic repeat, CRISPR）技術是最新出現的一種基因組編輯工具，它能夠完成RNA導向的DNA識別及編輯。與其它基因組編輯工具相比，CRISPR技術更易於操作，具有更強的可擴展性。 本文將以上述三種技術爲例，介紹並探討新一代位點特異性基因組工程技術的生物學原理、未來發展趨勢，及其在遺傳學研究領域的作用和潛在的醫學應用前景。 一、TALEN技術 TAL效應因子（TAL effector, TALE）最初是在一種名爲黃單胞菌（Xanthomonas sp.）的植物病原體中作爲一種細菌感染植物的侵襲策略而被發現的。這些TALE通過細菌 III類分泌系統（bacterial type III secretion system）被注入植物細胞中，通過靶定效應因子特異性的基因啓動子來調節轉錄，來促進細菌的集落形成。由於TALE具有序列特異性結合能力，研究者通過將FokI核酸酶與一段人造TALE連接起來，形成了一類具有特異性基因組編輯功能的強大工具，即TALEN。 近年來， TALEN已廣泛應用於酵母、動植物細胞等細胞水平基因組改造，以及擬南芥、果蠅、斑馬魚及小鼠等各類模式研究系統。2011年《自然·方法》（Nature Methods）將其列爲年度技術，而2012年的《科學》（Science）則將TALEN技術列入了年度十大科技突破，針對該文的評論更是給予它基因組的巡航導彈技術的美譽。 1. TALEN結構及技術原理 1.1 TALEN的典型結構 如前文所述，典型的 TALEN由一個包含覈定位信號（Nuclear localization signal, NLS）的N端結構域、一個包含可識別特定 DNA序列的典型串聯TALE重複序列的中央結構域，以及一個具有FokI核酸內切酶功能的C端結構域組成。不同類型的TALEN元件識別的特異性DNA序列長度有很大區別。一般來說，天然的TALEN元件識別的特異性DNA序列長度一般爲17-18bp；而人工TALEN元件識別的特異性DNA序列長度則一般爲14-20bp。
圖1 TALEN的結構。（A）與靶點DNA（灰色顯示，PDB ID：3UGM）結合的TALE蛋白。每一個獨立的TALE重複序列元件包含33到35個氨基酸殘基，這些TALE重複序列元件能夠通過兩個高變異度的殘基（即重複可變雙殘基，RVD，棍狀顯示）來識別一個單一的鹼基對。（B）TALE核酸酶（TALEN）形成二聚體結合DNA的動畫演示。TALEN目標位點由兩個TALE結合位點組成，這兩個位點間通過不同長度的間隔區序列（12-20bp）分開。 TALE可以被設計成僅僅識別左半側位點或右半側位點。圖片來源： Thomas Gaj, Charles A. Gersbach, and Carlos F. Barbas III. (2013) ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology, 31(7): 397-405. 1.2 TALEN技術的原理與步驟 TALEN技術的原理並不複雜，即通過 DNA識別模塊將TALEN元件靶向特異性的DNA位點並結合，然後在FokI核酸酶的作用 下完成特定位點的剪切，並藉助於細胞內固有 的同源定向修復（HDR）或非同源末端連接 途徑（NHEJ）修復過程完成特定序列的插入 （或倒置）、刪失及基因融合（圖2）。
圖2 TALEN進行基因組編輯的原理。利用位點特異性核酸酶可以進行基因組編輯，而核酸酶誘導的DNA雙鏈斷裂（DSB）可由同源定向修復（HDR）或非同源末端連接途徑（NHEJ）來修復。（A）在供體質粒（donor plasmid）暴露出延長的同源臂（homology arm）的情況下，HDR可能導致插入的單個或多個轉基因發生改變或取代原有的基因。（B）在缺失供體質粒的情況下，NHEJ介導的修復會產生小的插入或刪失突變，並可能導致目標基因被破壞；在有雙鏈寡核苷酸或線狀供體質粒存在的情況下，這些DNA片段可能通過NHEJ介導的連接反應插入；同時誘導兩個DSB的產生則會引起刪失、插入和易位突變。圖片來源：Thomas Gaj, Charles A. Gersbach, and Carlos F. Barbas III. (2013) ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology, 31(7): 397-405. TALEN技術的核心原理就是在同一個蛋白（TALEN）上有序地實現引導進入細胞核、靶位點DNA的特異性識別和靶位點DNA的切割這三個不同的功能，這一點在上述TALEN典型結構一節中已作了較爲詳細的描述。在具體操作中，例如在實驗室條件下，實現TALEN的關鍵就在於完成DNA的特異性識別功能，一般說來分爲兩個步驟。圖3與圖4分別以“鉑金門”TALEN構建系統（Platinum Gate TALEN construction system）和商業化的easyT體系爲例，展示了實驗操作中TALEN元件的構建。
圖 3 “鉑金門”TALEN構建系統TALEN元件構建操作示意圖。步驟一，四個或更少的組件被連接到陣列質粒（array plasmid）上；步驟二，構建好的陣列隨後被連接到哺乳動物表達載體中；白色和粉色的長方形分別表示在BsaI和Esp3I限制性內切酶切割後留下的粘性末端；藍色字母代表RVD，紅色字母代表non-RVD變化，黃色長方形代表後一半重複。圖片來源：Tetsushi Sakuma, Hiroshi Ochiai, Takehito Kaneko, Tomoji Mashimo, Daisuke Tokumasu, et al. (2014) Repeating pattern of non-RVD variations in DNA-binding modules enhances TALEN activity. Science Report, 3(3379): 1-8.
圖 4 “easyT”TALEN構建系統TALEN元件構建操作示意圖。（A）包含一個長度爲18.5個組件的 TALE重複元件的TALEN體系示意圖。該TALE重複元件由20個單體單位（monomer unit）組裝而成。單體單位的邊界在組裝過程中發生了移位。（B）TALEN克隆示意圖。第一步，由四個單體通過連接反應組裝成4聚體；第二步，4聚體（4-mers）進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳，膠回收並濃縮；最後，在第二次連接反應中，4聚體被組裝到TALEN骨架質粒（backbone plasmid）上；黃色和藍色箭頭分別表示4聚體擴增時的正向引物與反向引物。圖片來源：Tomonori Katsuyama, Arslan Akmammedov, Makiko Seimiya, Samuel C. Hess, Cem Sievers and Renato Par. (2013) An efficient strategy for TALEN-mediated genome engineering in Drosophila. Nucleic Acids Research, 41(17): e163-171. 1.2.1構建TAL靶點識別模塊 TAL的DNA特異性識別單位是間隔32個恆定氨基酸殘基的二聯氨基酸。二聯氨基酸與AGCT這4個核苷酸鹼基有一一對應的關係：腺嘌呤（A）由NI識別、胸腺嘧啶（T）由NG識別、鳥嘌呤（G）由NN識別，而胞嘧啶（C）則由HD識別。實驗操作中，我們通過 靶位點的DNA序列可以反推能特異性識別這一序列的二聯氨基酸序列，從而構建TAL靶點識別模塊。 1.2.2 TAL靶點識別模塊的克隆與表達 根據之前對TALEN結構的介紹，我們需要將上一步驟中根據目標DNA序列構建好的一對TAL靶點識別模塊與N端的核定位序列、C端的FokI酶連接起來，才能得到一個完整的TALEN元件。一般來說，我們可以採用專門用於構建TALEN的真核表達載體體系，將一對特異性的TAL靶點識別模塊克隆進該載體中，再通過轉染等方式導入細胞內。這種體系一般由供體質粒（donor plasmid，提供單基、二聯及三聯等類型的TAL模塊）和骨架質粒（backbone plasmid，用於構建TALEN並表達構建好的TALEN）兩類質粒構成，常用的TALEN體系有RCIscript-GoldyTALEN和pC-GoldyTALEN、TAL5-BB和pTAL6-BB及pCS2TAL3-DD和pCS2TALE-RR等。 2. TALEN技術的應用及近期發展 雖然 TALEN技術的基本原理並不難理解，但其發現過程卻較爲曲折。從1989年首次發現TAL起，研究者前後歷時近21年才研究清楚TAL的工作原理。自2010年正式發明 TALEN技術以來，全球範圍內多個研究小組利用體外培養細胞、酵母、擬南芥、水稻、果蠅及斑馬魚等多個動植物體系驗證了TALEN的特異性切割活性。 2.1 TALEN技術的應用 2011年北京大學（Peking University）的 Zhang等人首次使用TALEN技術在斑馬魚中成功實現了定向突變和基因編輯；而愛荷華州立大學（Iowa State University）的Wang等人則在2012年，也以斑馬魚爲模式動物，並首次使用TALEN技術在活體內完成了特定 DNA的刪除、人工DNA插入等較爲複雜的操作。隨後TALEN技術在植物、大小鼠的基因組改造等方面的應用也順利完成。而2013年 Zhang使用TALEN誘導了DNA雙鏈斷裂，提高同源定向修復效率，在斑馬魚中實現了同源重組基因打靶。 2.2 TALEN的近期發展 如前所述，經典的 TALEN體系已經廣泛應用，越來越多的實驗室以及實驗外包公司均能很好地完成TALEN相關實驗，但是基本限於單基因的插入或敲除操作，而且主要用於單個基因功能的研究。2013年，首爾國立大學化學系和國家基因工程創新舉措研究中心的Kim課題組建立了一個全基因組規模（genome-scale collection）的TALEN體系，他們系統地選取了人類基因組中高度特異性的序列作爲靶位點以避開脫靶（offtarget）效應，通過一種高通量克隆體系，一次性構建了18, 740個編碼蛋白的基因的 TALEN質粒。 在這項研究中，研究者以一種巧妙的方式優化了TALEN質粒的結構，以檢測插入靶位點後質粒對應位置上EGFP的表達的方式檢測了TALEN靶位點插入成功率（圖5a）。通過這一方式，他們可以研究不同間隔序列下特定靶位點插入效率（圖 5b&c），從而針對每一個靶位點，都能選出最佳的TALEN體系結構。2014年2月，北京大學生命科學學院魏文勝課題組依託於一種自主研發的TALE蛋白組裝技術（ULtiMATE system）完成了全部 TALE元件的解碼工作。 近年來，隨着TALEN技術逐漸成熟，全球範圍內各實驗室已廣泛使用TALEN技術來 完成基因打靶操作。 TALEN通過與顯微注跨越幹細胞研究、基因治療、神經網絡，以及射、慢病毒感染等技術手段相結合，其應用範動植物育種等多個領域，強力推動生命科學的圍越來越廣。相信在不遠的將來，其應用必將進步。
圖 5 TALEN元件的優化。（a）基於RFP-GFP報告基因的各TALEN元件基因編輯活動的檢測方法圖示，只有插入靶位點後才能修正緊隨其後EGFP的讀碼框以表達EGFP；（b）TALEN靶點和TAL效應子與FokI結構域融合連接區域的氨基酸序列；（c）TALEN基因編輯活力的比較。報告基因質粒包含靶位點，靶位點中有各類間隔序列（彩色標記），將報告基因質粒和TALEN質粒共轉染到HEK293細胞中，然後使用流式細胞術分離GFP陽性的細胞。圖片來源：Yongsub Kim, Jiyeon Kweon, Annie Kim, Jae Kyung Chon, Ji Yeon Yoo, Hye Joo Kim1, Sojung Kim et al. (2013) A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nature Biotechnology, 31(3): 251-260. 二、ZFN技術 鋅指核酸酶（Zinc-finger nuclease, ZFN）又名鋅指蛋白核酸酶（ZFPN），它是一類人工合成的限制性內切酶，由鋅指DNA結合域（zinc finger DNA-binding domain）與限制性內切酶的DNA切割域（DNA cleavage domain）融合而成。研究者可以通過加工改造ZFN的鋅指DNA結合域，靶向定位於不同的DNA序列，從而使得ZFN可以結合複雜基因組中的目的序列，並由DNA切割域進行特異性切割。此外，通過將鋅指核酸酶技術和胞內DNA修復機制結合起來，研究者還可以自如地在生物體內對基因組進行編輯。目前，在大量植物、果蠅、斑馬魚、蛙、大/小鼠及牛等物種中，ZFN技術已被廣泛應用於靶向基因的突變，通過人工修改基因組信息可以產生遺傳背景被修改的新物種。該技術在醫學領域也具有非常重大的價值，對於疾病的基因治療有潛在意義，具有非常廣泛的應用前景。 1. ZFN結構及基本技術原理 1.1 ZFN的結構 顧名思義，ZFN由負責特異性識別序列的鋅指DNA結合域和進行非特異性限制性內切酶切割的DNA切割域兩部分組成（圖6）。其中鋅指DNA結合域部分一般包含3個獨立的鋅指（Zinc finger, ZF）重複結構，每個鋅指結構能夠識別3個鹼基，因而一個鋅指DNA結合域可以識別9bp長度的特異性序列（而ZFN二聚體，則包含6個鋅指，可以識別18bp長度的特異性序列）。目前最常用的ZF結構爲Cys2His2鋅指，其結構由大約30個氨基酸包裹一個鋅原子構成。研究表明，增加鋅指的數量可以擴大ZFN特異性識別DNA序列的長度，從而獲得更強的序列特異性。具體操作中，則一般通過模塊化組合單個ZF，來獲得特異性識別足夠長的DNA序列的鋅指DNA結合域。ZFN的三維空間結構如圖6所示。
圖6 ZFN的結構。該圖爲DNA雙鏈與一對ZFN結合的示意圖。每一對鋅指用粉色標出，圖像左側的鋅指用帶狀結構表示，右側的鋅指用填充空間結構表示；FokI的DNA切割域如藍色區域所示；位於連接域與切割域之間的長度爲四個氨基酸的“連接區”（linker）如灰色填充空間結構所示。DNA雙鏈的糖-磷酸骨架爲橙色，鹼基顯示爲藍色，在ZF結合位點兩側的DNA區域間距爲6bp。該示意圖由Smith等人在2000年根據鋅指蛋白與DNA結合的晶體結構數據所編譯而來。圖片來源：Carroll D. (2011) Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188(4): 773-82. 此外，如果鋅指DNA結合域與目的DNA序列能夠完美配對，即便只含3個ZF結構的ZFN也能在基因組中特異性地結合18bp長度的序列。通過研究者長期的努力，識別每一種三聯鹼基的64種鋅指組合中已有大部分被發現並編撰成目錄，這些相關數據也都能夠在公共的數據庫或者文獻中被檢索到。針對每一條需要識別的目標序列，我們都可以使用與密碼子對應的類似方式對鋅指結構進行模塊化組裝（modular assembly），從而獲得能夠識別特定DNA序列的鋅指蛋白結構。 ZFN的切割域與DNA結合域通過連接區（linker）結合。在ZFN中應用最廣泛的DNA切割域來自IIS型限制性內切酶FokI。由於切割域與DNA鏈的結合能力較弱，因此DNA切割域必須以二聚體的形式發揮作用。構建鋅指核酸酶時，應針對DNA各鏈上的鄰近區域設計兩條ZFN，使其DNA切割域能夠位於雙鏈的同一位置，以達到最佳的切割效果。兩條ZFN之間具有被稱爲“間隔區”的spacer結構，該結構的長度以5～6bp爲宜，7bp也能正常工作，合理的“間隔區”設計才能保證ZFN二聚體擁有最佳的工作空間（圖7）。
圖7 ZFN特異性識別DNA並與DNA結合示意圖。每個DNA識別域包含三個鋅指，鋅指從N端開始命名，在圖中標示爲F1、F2、F3。每個鋅指結構分別與3個鹼基發生直接接觸，由此產生特異性。單獨的FokI切割域不具有特異性識別能力，但當與鋅指結構相連，並與另一個FokI切割域形成二聚體後，便能夠對DNA雙鏈進行切割。兩個切割位點之間的距離約爲4bp，如箭頭所示。圖片來源：Carroll D. (2011) Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188(4): 773-82. 1.2 ZFN技術的初步應用及其機制 ZFN技術可用於基因組編輯。針對目的基因序列設計併合成ZFN後，使之對DNA進行特異性切割，從而形成DNA雙鏈斷裂區（Double-StrandedBreaks,DSB）；通過破壞非同源末端鏈接（non-homologous end joining, NHEJ）使目的基因失活，或藉助同源重組（homologous recombination, HR）等方式完成DNA的修復連接，可以使斷裂的DNA雙鏈重新黏合。將以上兩步結合起來便可以完成一般的基因組編輯操作，具體機制如圖8所示。
圖8 通過ZFN技術對基因進行編輯操作的幾種主要方式示意圖。通過對靶基因編碼區域的目標序列進行ZFN切割，可以產生DSB，導致基因無法通過NHEJ修復而失活，從而達到基因敲除的目的。通過在兩端引入wildtype（野生型,WT）DNA模板，並藉助於同源重組（homologous recombination,HR）的修復，整個表達元件（expression cassette）可以替換髮生DSB的區域，從而可以修復具有致病性的突變基因。通過提供能夠覆蓋ZFN切割位點附近整個核苷酸多態性區域的DNA序列，同樣可以利用同源重組實現基因的修復，箭頭顯示的是ZFN切割位點。圖片來源： Palpant NJ, Dudzinski D. (2013) Zinc finger nucleases: looking toward translation. Gene Ther, 20(2):121-7. ZFN技術具有重大的應用價值。在科研和農業領域，該技術既可用於基因的敲除失活，也可用於導入目標基因，使基因激活或阻斷，或者人爲改造基因序列，使之符合人們的要求。在醫療領域，經ZFN技術改造後導入治療性基因的質粒或幹細胞可被導入人體，實現基因治療。此外，ZFN技術也可以直接用於有害基因的修補替換或是直接刪除，以達到相關治療目的。ZFN技術具有極佳的特異性和效率，因此能將基因/基因組錯誤修改的風險降到最低。從理論上來說，研究人員甚至可以在任何物種中，對處於任意生長時期的細胞進行ZFN操作，可以自如地修改其基因，而還不破壞細胞狀態。 2. ZFN技術的進展和應用 目前，除了傳統的DNA重組技術外，合成具有可控特異性的鋅指結構域的平臺主要有兩個：其一爲Sangamo Bioscience公司所獨有，在兩個鋅指的基礎上生產更多 ZF的鋅指核酸酶，並與Sigma公司合作，通過 Compozr項目銷售預製的鋅指；另一個是由鋅指聯盟（Zinc Finger Consortium）開發的 Oligomerized PoolENgineering（OPEN）技術，該技術主要通過大腸桿菌雙雜交系統（E. coli two-hybrid selection system）來對ZFN進行篩選，這是一個開放平臺，其模塊化的鋅指庫和試劑皆可免費獲得。 早期的 ZFN技術一般採用普通的 FokI-ZFN二聚體形式來保證其切割效率，但使用過程中可能因同源二聚體效應（homodimerization）而導致脫靶，影響切割特異性。Miller等人和Szczepek等人在2007年分別開發出FokI的變體，使得ZFN可以在異源二聚體（heterodimer）形式下使用，從而在保證切割效率的前提下大大提升了特異性，並減少了細胞毒性，具有更優良的科研和應用價值。 ZFN雖然是剛剛興起的技術，但已被越來越廣泛地應用到科研和醫療領域中。ZFN技術的先導之一，Sangamo Biosciences公司正在和賓夕法尼亞大學合作，研究ZFN技術通過介導核酸酶引起CCR5基因座的破壞。這一研究成果在治療HIV中具有廣闊的應用前景，而且ZFN技術也已嘗試應用於杜氏肌營養不良症（Duchenne muscular dystrophy）、21三體綜合徵等遺傳疾病的基因治療（圖9）。
圖9使用ZFN技術治療艾滋病和遺傳疾病的示意圖。（上）治療艾滋病：使用ZFN技術切割CCR5受體的編碼序列，以破壞CCR5膜受體的功能，使HIV失去細胞感染能力。（中）治療杜氏肌營養不良症：使用ZFN技術進行基因組編輯，插入小段序列將Dystrophin基因的讀碼框恢復正常。（下）治療21三體綜合徵（唐氏綜合症）：使用ZFN插入HSV的TK基因，直接造成一條21號染色體自發丟失；使用ZFN在一條21號染色體上插入Xist基因，使這整個染色體失去功能。圖片來源：Hongmei Lisa Li, Takao Nakano, and Akitsu Hotta. (2014) Genetic correction using engineered nucleases for gene therapy applications. Development Growth Differentiation, 56(1): 63-77. 早期的ZFN技術需要藉助病毒或質粒載體的方式進入細胞，之後再表達形成具有功能的蛋白。但Barbas等人發現ZFN可以依靠自身鋅指部分跨過細胞膜進入細胞，並發揮作用，如此則可避免載體插入重要基因而引起突變等潛在風險。近年來，一系列應用ZFN所取得的振奮人心的科研成果相繼發表在高水平雜誌上，如使患有人血液疾病乙型血友病（hemophilia B）的小鼠恢復血液凝結功能；在幹細胞領域，研究者使用ZFN技術精確修正基因突變，從而使與人體疾病相關的缺陷蛋白失活等。 3.ZFN技術的缺陷 ZFN技術雖然簡易實用，但也具有一定缺陷。ZFN對DNA的剪切需要兩個FokI切割區域的二聚化，並且需要至少一個識別單元結合DNA。DNA識別域雖然具有較強的特異性識別能力，但由於ZFN剪切的過程並不完全依賴同源二聚體的形成，所以一旦形成異源二聚體，就很可能造成脫靶效應，並最終可能導致DNA的錯配和序列改變，產生較強的細胞毒性。當這些不良影響積累過多，超過細胞修復機制承受的範圍時，便會引起細胞的凋亡。另一方面，該手段仍然受到現有生物學領域研究手段的限制，因此在細胞內部操作的精確程度和後果都較難預料。如果ZFN引起相關基因突變，則可能會導致一系列意想不到的後果，在與人體相關的應用領域，甚至可能引發癌症。另外，ZFN作爲基因治療的手段之一，如果在生物體內使用，可能會引發免疫反應。現有的研究手段尚不能預測引入的ZNF蛋白是否會引起免疫系統的進攻。並且到目前爲止，ZFN技術只能用於體外操作（in vitro），在對人體提取的細胞進行處理之後，再導入回輸到病人體內。而直接向患者體內導入相關ZFN元件進行基因編輯處理則具有較大的潛在風險，且效率不高。以上諸多限制導致人體相關的ZFN操作較爲繁瑣，難以推廣應用。 三、CRISPR/Cas系統 不論是TALEN技術還是ZFN技術，其定向打靶都依賴於DNA序列特異性結合蛋白模塊的合成，這一步驟非常繁瑣費時。而CRISPR/Cas技術作爲一種最新涌現的基因組編輯工具，能夠完成RNA導向的DNA識別及編輯。CRISPR/Cas技術使用一段序列特異性向導RNA分子（sequence-specific guide RNA）引導核酸內切酶到靶點處，從而完成基因組的編輯。CRISPR/Cas系統的開發爲構建更高效的基因定點修飾技術提供了全新的平臺。 1.CRISPR/Cas系統元件與特徵 CRISPR/Cas系統最早是在細菌的天然免疫系統內發現的，其主要功能是對抗入侵的病毒及外源DNA。1987年大阪大學（OsakaUniversity）的研究人員在E.coliK12的鹼性磷酸酶基因附近發現了成簇的規律間隔的短迴文重複序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR），其結構如圖10所示，目前普遍認爲有40%的細菌基因組具有這樣的結構。
圖10 CRISPR的結構（以嗜熱鏈球菌LMD-9基因組CRISPR1/Cas系統的位點爲例）。（上）Cas基因由藍色表示，包括廣泛存在的cas1和cas2，II類系統特徵基因cas9和csn2。重複間隔物陣列（CRISPR）由黑色表示。（下）CRISPR的重複序列（repeat）和間隔物序列（spacer）分別用黑色菱形、灰色長方形表示。縮寫：L，前端；T，末端重複；數字代表間隔物序列被獲取的順序。圖片來源：Rodolphe Barrangou1 and Philippe Horvath. (2012) CRISPR: New Horizons in Phage Resistance and Strain Identification. Annual Review of Food Science, 3: 143-162. CRISPR/Cas系統由CRISPR序列元件與Cas基因家族組成。其中CRISPR由一系列高度保守的重複序列（repeat）與同樣高度保守的間隔序列（spacer）相間排列組成。而在CRISPR附近區域還存在着一部分高度保守的CRISPR相關基因（CRISPR-associated gene, Cas gene），這些基因編碼的蛋白具有核酸酶活性的功能域，可以對DNA序列進行特異性的切割。 2. CRISPR/Cas系統工作原理 CRISPR/Cas作爲原核生物中普遍存在的一種系統，最初的功能就是識別外源性入侵的核酸序列，並對其進行特異性降解，以達到抗病毒的作用。這一過程分兩步進行——crRNA的合成及在crRNA引導下的RNA結合與剪切，具體機制如圖11所示，包含crRNA的生物學合成和RNA的結合與剪切兩大步驟。
圖11 CRISPR抗病毒運行機制。（上）crRNA和Cas蛋白的生物學合成：Cas基因轉錄爲mRNA，隨後翻譯爲Cas蛋白，Cas蛋白可以形成CASCADE複合體（抗病毒防禦的CRISPR相關複合體）。CRISPR重複間隔物陣列轉錄爲全長的前體crRNA（pre-crRNA），隨後經過加工成爲crRNA。這些crRNA包含部分的重複間隔序列。（下左）間隔物（spacer）獲取：噬菌體的原間隔物序列，一般在PAM（原間隔物模塊）的旁邊，可由Cas蛋白識別，併產生一個新的重複間隔物單元，插在原有的重複間隔物陣列前端。（下右）干擾：由crRNA介導的CASCADE核糖核蛋白複合體識別入侵的同源序列，在PAM附近的原間隔物序列處將這些雙鏈DNA（dsDNA）截斷。圖片來源：Rodolphe Barrangou1 and Philippe Horvath. (2012) CRISPR: New Horizons in Phage Resistance and Strain Identification. Annual Review of Food Science, 3: 143-162. 2.1 crRNA的生物學合成 CRISPR區域第一個重複序列上游有一段CRISPR的前導序列（Leader sequence），該序列作爲啓動子來啓動後續CRISPR序列的轉錄，轉錄生成的RNA被命名爲CRISPRRNA（簡稱crRNA）。 2.2 RNA的結合與剪切 CRISPR/Cas系統中crRNA與tracrRNA（反式激活的crRNA）形成嵌合RNA分子，即單向導RNA（Single guide RNA,sgRNA）。sgRNA可以介導Cas9蛋白在特定序列處進行切割，形成DNA雙鏈斷裂（Double-Stranded Break, DSB），完成基因定向編輯等的各類操作。 3. 不同類型的CRISPR/Cas系統 根據功能元件的不同，CRISPR/Cas系統可以分爲I類系統、II類系統和III類系統。這三類系統又可以根據其編碼Cas蛋白的基因不同而分爲更多的亞類。不同類型CRISPR/Cas系統完成干擾的步驟也有所不同（圖12）。
圖12 三種不同的CRISPR/Cas干擾系統作用步驟。CRISPR/Cas系統根據分類有三種，其共同特點是都具有DNA區域（藍色）、靶向crRNA（紅色）和原間隔物模塊（PAM，綠色）。在I類系統（A）中，入侵的DNA有Cascade:crRNA複合體識別，PAM模塊則能促進外源性DNA的識別，隨後核酸酶Cas3被募集並將目標DNA降解。在II類系統（B）中，只需要單獨的Cas9蛋白即可完成干擾，並不依賴一個多蛋白複合體，Cas9和反式激活的crRNA（tracrRNA）、前crRNA（pre-crRNA）形成複合體，該複合體促使RNA酶III將前crRNA加工爲成熟的crRNA。在III類系統（C）中，一個多蛋白複合體（Csm或Cmr）或Cas6促進前crRNA轉化爲成熟的crRNA，最終導致目標DNA的降解。圖片來源：Hagen Richter, Lennart Randau and André Plagens. (2013) Exploiting CRISPR/Cas: Interference Mechanisms and Applications. International Journal of Molecular Science, 2013, 14, 14518-14531. I類和III類CRISPR/Cas系統進行干擾時只需要crRNA和Cas蛋白兩種元件的參與，而II類CRISPR/Cas系統包括crRNA、tracrRNA和Cas蛋白三種元件。其中II類CRISPR/Cas系統最先在改造後用於小鼠和人類基因組編輯，同時也是目前研究最爲充分的系統。根據Cas蛋白的類型不同分爲三個亞類：II-A類含有Cas1、Cas2、Cas9和Csn2樣蛋白；II-B類含有Cas1、Cas2、Cas4和Csx12樣Cas9四種蛋白；II-C類則有Cas1、Cas2及Cas9三種蛋白。此外，II類CRISPR/Cas系統也是目前最常用於人工基因組編輯的CRISPR/Cas系統，其靶向基因組編輯的步驟如圖13所示。
圖13 利用一段小嚮導RNA（sgRNA）:Cas複合體系統靶向基因組編輯的步驟。將編碼密碼子優化的Cas9（紅色）序列、一段覈定位序列（NLS）和一段包括目標靶序列的小嚮導RNA（sgRNA，黃色）序列同時構建在一個質粒中，再將質粒轉染進目標細胞。一個有功能的sgRNA:Cas9干擾複合體會在細胞內完成組裝，該複合體會在PAM結構的上游目標DNA序列上誘導產生一個雙鏈斷裂（DSB），而DSB則能被宿主細胞的DNA修復系統、同源重組系統（HR）和非同源末端連接途徑（NHEJ）修復。HR系統以宿主的等位基因爲模板復原野生型序列，將序列恢復爲斷裂前的狀態；而容易出錯的NHEJ系統則會在目標位點（灰色）引入插入和刪失。使用一段合成的供體DNA模板與Cas系統質粒共轉染，可以誘導HR（藍色），提高編輯效率。圖片來源：Hagen Richter, Lennart Randau and André Plagens. (2013) Exploiting CRISPR/Cas: Interference Mechanisms and Applications. International Journal of Molecular Science, 2013, 14, 14518-14531. 4. CRISPR技術的應用 自1987年大阪大學（Osaka University）的研究人員在細菌的天然免疫系統中發現CRISPR/Cas系統以來，CRISPR作爲一種潛在技術在很長時間內都沒有得到重視與發展。近年來，由於基因工程技術的突飛猛進，CRISPR/Cas儼然已經成爲科學界最炙手可熱的熱點之一，被廣泛應用於各類體內和體外體系的遺傳學改造、轉基因模式動物的構建，甚至基因治療領域。 2013年初的《科學》第339卷第6121期連載了兩篇具有重要意義的CRISPR技術論文，其中一篇描述的是麻省理工學院（Massachusetts Institute of Technology, MIT）Zhang的研究組使用CRISPR技術完成了多重基因組編輯，另一篇描述了哈佛醫學院（Harvard Medical School）Church的研究組首次使用CRISPR技術完成了RNA介導的人類基因組編輯（圖14）。他們使用基因工程學方式修改了細菌的II類CRISPR系統，並比較了這種新系統與傳統TALEN方法在基因組編輯方面的效率差異，結果發現這種方式比TALEN有更快的時效性。同時，該研究組還建立了一個覆蓋約40.5%外顯子的基因組水平的gRNA羣。
圖14 使用一種基因工程修飾的II類CRISPR系統完成了人類細胞的基因組編輯。（A）人類細胞的RNA介導基因打靶涉及C末端包含SV40覈定位信號（nuclear localization signal）的Cas9蛋白和一個或一個以上的嚮導RNA（guide RNA, gRNA）的共表達（上半部分共表達兩個質粒的結構示意圖），這一過程由人類U6聚合酶III（U6 polymerase III）的啓動子介導。Cas完成DNA雙鏈的解聚並在gRNA（guide RNA）的識別下切割特定的DNA雙鏈位置，該過程前提是其3’端有序列正確的原間隔物模塊（protospacer-adjacent motif, PAM）。原則上任何符合GN20GC序列模式的基因組序列都可以被特異性靶向識別（下半部分靶向識別的作用機制示意圖）。（B）一個基因組整合的GFP編碼序列被一個終止密碼子和一個長達68bp的基因組片段在AAVS1位點的插入打斷，使用合適的供體序列通過同源重組（HR）的方式修復GFP序列能誘使GFP功能恢復，形成GFP陽性的細胞，之後則可通過流式細胞術（FACS）分離。T1和T2嚮導RNA靶向序列定位於AAVS1片段區域。TALEN元件的兩個單體的結合位點用上劃線表示。圖片來源：DiCarlo, Julie E. Norville1, George M. Church. (2013) RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science, 339(6121): 823-826. 同年，中國科學院動物研究所周琪研究員利用CRISPR-Cas技術在大鼠中實現了多基因同步敲除；而懷特海德研究所（Whitehead Insititute）的 Jaenisch利用CRISPR-Cas技術構建了條件敲除的小鼠轉基因模型；北京大學生命科學學院的瞿禮嘉教授課題組利用CRISPR-Cas系統成功地實現了對水稻特定基因的定點突變；杜克大學Pratt工程學院基因組科學研究所的Gersbach研究組則已經開始嘗試使用CRISPR技術進行基因治療。僅這一年內，CRISPR/Cas領域就取得了如此多鼓舞人心的突破，簡直可以用一日千里來形容了。 四、三種基因定點修飾技術的總結與比較 1. TALEN、ZFN和CRISPR/Cas的共同點 從分子生物學角度看來，基因定點修飾操作可以分爲敲入（knock in）、敲除（knock out）、刪失（deletion）及基因融合（gene integration）這幾種類型。而其中敲除又有多重敲除（multiplex knockout）和條件敲除（conditional knockout）等特殊類型，本質上均是利用非同源末端鏈接途徑（NHEJ）修復和同源重組（HR）修復，聯合特異性DNA的靶向識別及核酸內切酶完成的DNA序列改變，其總體模式如圖15所示。
圖15 使用 TALEN、ZFN和CRISPR等技術的分子生物學途徑示意圖。圖片來源：Tomoji Mashimo. (2014) Gene targeting technologies in rats: Zinc finger nucleases, transcription activator-like effector nucleases, and clustered regularly interspaced short palindromic repeats. Development Growth Differentiation, 56(1): 46–52. 近年來TALEN、ZFN和CRISPR/Cas三大基因定點修飾技術已經廣泛應用於生命科學與醫學的各個方面，包括但不侷限於轉基因動植物模型的構建、基因治療及轉基因育種等。雖然TALEN、ZFN和CRISPR/Cas三種技術在技術細節上有着各自獨一無二的特色，但它們在各類應用中的基本模式卻是相似的，例如在轉基因大鼠的構建上，三種技術均是以顯微注射的方式進入大鼠胚胎的（圖16）。
圖16 使用基因工程學方式構建基因靶向敲除大鼠的示意圖。在大鼠（rat）胚胎中以顯微注射的方式使用TALEN、ZFN和CRISPR等技術進行基因打靶。圖片來源：Tomoji Mashimo. (2014) Gene targeting technologies in rats: Zinc finger nucleases, transcription activator-like effector nucleases, and clustered regularly interspaced short palindromic repeats. Development Growth Differentiation, 56(1): 46–52. 2. TALEN、ZFN和CRISPR/Cas的技術特點 雖然TALEN、ZFN和CRISPR/Cas均能用於與基因組定點修飾相關的各類操作，應用範圍有很大程度的重合，但是這三種技術有各自不同的技術特點和適用範圍（表1），因此實際操作中，實驗者都會根據實際需要選擇合適的基因組定點修飾技術方案。 表1 TALEN、ZFN和CRISPR/Cas三種基因定點修飾技術特點的比較
表格來源：Hongmei Lisa Li, Takao Nakano, and Akitsu Hotta. (2014) Genetic correction using engineered nucleases for gene therapy applications. Development Growth Differentiation, 56(1): 63-77. TALEN技術是目前商業化最成功的技術，雖然將單個的TALEN模塊進行組裝需要大量的分子克隆和測序操作，十分繁瑣，但是很多商業公司可以提供組裝好的三聯密碼子TALEN模塊，甚至四聯密碼子TALEN模塊，這樣就大大縮短了構建TALEN元件的實驗週期。不過也正是因爲如此，絕大多數實驗室都難以自行完成TALEN技術的完整操作，對其推廣造成了障礙。 ZFN技術則是最早被廣泛使用的基因組定點修飾技術，各大平臺均比較完善，有很多可以直接使用的資源，然而由於其自身的三聯屬性，其設計比TALEN更爲繁瑣，而且高度依賴於目標序列及其上下游序列，還具有脫靶率高及細胞毒性大等諸多限制性因素。 CRISPR/Cas技術擺脫了合成並組裝具有特異性DNA識別能力蛋白模塊的繁瑣操作，其gRNA的設計和合成工作量遠遠小於TALEN和ZFN技術的DNA識別模塊的構建過程，且毒性遠遠低於ZFN技術。然而CRISPR/Cas技術也有上下文依賴性，目前只能應用於上游有PAM序列的靶位。 TALEN、ZFN和CRISPR/Cas三大基因組定點修飾技術應用於各個生物醫學領域的歷史都並不長，但近年來發展無比迅速，積累了大量的網絡資源和平臺資源。以模式動物果蠅（Drosophila melanogaster）的基因組定點修飾爲例，目前可查的基因組定點修飾相關數據庫已經多達十七個（表2）。 表2 現有的TALEN、ZFN及CRISPR相關設計數據庫資源
表格來源：Kelly J. Beumer, and Dana Carroll. (2014) Targeted genome engineering techniques in Drosophila. Methods, in press, DOI: 10.1016/j.ymeth.2013.12.002. 由於在技術特徵方面存在區別，TALEN、ZFN和CRISPR/Cas作爲不同的技術在研究領域上雖然有極高重複度，但一些特殊的研究領域，在這幾種基因組修飾工具的選擇上，依然具有較強的偏好性。例如在基因治療領域，不同技術在應用上也有不同的分工（表3）。 表3 工程修飾的核酸酶在人類遺傳病治療中的研究
參考文獻 1. Thomas Gaj, Charles A. Gersbach, and Carlos F. Barbas III. (2013) ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology, 31(7): 397-405. 2. Yongsub Kim, Jiyeon Kweon, Annie Kim, Jae Kyung Chon, Ji Yeon Yoo, Hye Joo Kim, Sojung Kim, Choongil Lee, et al. (2013). A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nature Biotechnology, 31(3): 233-239. 3. Yongsub Kim, Jiyeon Kweon, Annie Kim, Jae Kyung Chon, Ji Yeon Yoo, Hye Joo Kim1, Sojung Kim, et al. (2013) A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nature Biotechnology, 31(3): 251-260. 4. Chuanxian Wei, Jiyong Liu, Zhongsheng Yu, Bo Zhang, Guanjun Gao, Renjie Jiao. (2013) TALEN or Cas9 e Rapid, Efficient and Specific Choices for Genome Modifications. Journal of Genetics and Genomics, 40(1): 281-289. 5. Qiurong Ding, Youn-Kyoung Lee, Esperance A.K. Schaefer, Derek T. Peters1, Adrian Veres, Kevin Kim, Nicolas Kuperwasser, et al. (2012) A TALEN genome-editing system for generating human stem cell-based disease models. Cell Stem Cell, 12(2): 238–251. 6. Victoria M. Bedell, Ying Wang, Jarryd M. Campbell, Tanya L. Poshusta, Colby G. Starker, Randall G. Krug II, et al. (2012) In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature, 491(7422): 114-118. 7. Yang J, Zhang Y, Yuan P, et al. Complete decoding of TAL effectors for DNA recognition. Cell research, 2014, in press. 8. Dana Carroll. (2011) Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics, 188(4): 773-82. 9. Dana Carroll. (2008) Zinc-finger Nucleases as Gene Therapy Agents. Gene Therapy, 15(22): 1463–1468. 10. Palpant NJ, Dudzinski D. (2013) Zinc finger nucleases: looking toward translation. Gene Therapy, 20(2):121-7. 11. Severine Remy, Laurent Tesson, Severine Menoret, Claire Usal, Andrew M. Scharenberg, Ignacio Anegon. (2010) Zinc-finger nucleases: a powerful tool for genetic engineering of animals. Transgenic Research, 19(1): 363–371. 12. Eva-Maria Händel, and Toni Cathomen. (2011) Zinc-Finger Nuclease Based Genome Surgery: It’s All About Specificity. Current Gene Therapy, 11(1): 28-37. 13. NJ Palpant, and D Dudzinski. (2013 ) Zinc finger nucleases: looking toward translation. Gene Therapy, 20: 121-127. 14. Seokjoong Kim, and Jin-Soo Kim. (2011) Targeted genome engineering via zinc finger nucleases. Plant Biotechnology Reports, 5(1): 9-17. 15. Wu J, Kandavelou K, and Chandrasegaran S. (2007) Custom-designed zinc finger nucleases: what is next? Cellular and Molecular Life Sciences, 64(22): 2933-2944. 16. Rodolphe Barrangou1, and Philippe Horvath. (2012) CRISPR: New Horizons in Phage Resistance and Strain Identification. Annual Review of Food Science, 3(1): 143-162. 17. Hagen Richter, Lennart Randau, and André Plagens. (2013) Exploiting CRISPR/Cas: Interference Mechanisms and Applications. International Journal of Molecular Science, 14(1): 14518-14531. 18. Le Cong, Ann Ran, David Cox, Shuailiang Lin, Robert Barretto, Naomi Habib, et al. (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 339(6121): 819-823. 19. Prashant Mali1, Luhan Yang, Kevin M. Esvelt, John Aach, Marc Guell1, James E. DiCarlo, Julie E. Norville1, George M. Church. (2013) RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science, 339(6121): 823-826. 20. Wenyan Jiang, David Bikard, David Cox, Feng Zhang, and Luciano A Marraffini. (2013) RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology, 31(3): 233-239. 21. Woong Y Hwang, Yanfang Fu, Deepak Reyon, Morgan L Maeder, Shengdar Q Tsai, Jeffry D Sander, Randall T Peterson, J-R Joanna Yeh, and J Keith Joung. (2013) Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology, 31(3): 227-229. 22. Judith Reeks, James H. Naismith, and Malcolm F. White. (2013) CRISPR interference: a structural perspective. Biochemistry Journal, 453(1): 155–166. 23. Kelly J. Beumer, Jonathan K. Trautman, Michelle Christian, Timothy J. Dahlem, Cathleen M. Lake, R. Scott Hawley, David J. Grunwald, Daniel F. Voytas, and Fand Dana Carroll. (2013) Comparing zinc finger nucleases and transcription activator-like effector nucleases for gene targeting in Drosophila. G3: Genes Genomes Genetics, 3(10): 1717-1725. 24. Hongmei Lisa Li, Takao Nakano, and Akitsu Hotta. (2014) Genetic correction using engineered nucleases for gene therapy applications. Development Growth Differentiation, 56(1): 63-77. 25. Tomoji Mashimo. (2014) Gene targeting technologies in rats: Zinc finger nucleases, transcription activator-like effector nucleases, and clustered regularly interspaced short palindromic repeats. Development Growth Differentiation, 56(1): 46–52. 26. Kelly J. Beumer, and Dana Carroll. (2014) Targeted genome engineering techniques in Drosophila. Methods, in press, DOI:10.1016/j.ymeth.2013.12.002. 27. Tomonori Katsuyama, Arslan Akmammedov, Makiko Seimiya, Samuel C. Hess, Cem Sievers and Renato Par. (2013) An efficient strategy for TALEN-mediated genome engineering in Drosophila. Nucleic Acids Research, 41(17): e163-171. 28. Tetsushi Sakuma, Hiroshi Ochiai, Takehito Kaneko, Tomoji Mashimo, Daisuke Tokumasu, et al. (2014) Repeating pattern of nonRVD variations in DNA-binding modules enhances TALEN activity. Science Report, 3(3379): 1-8. |
