這是2012 年的3月份的一篇nature protocol ，下面是我作爲一個RNA-seq 方面的菜鳥在根據這個protocol 跑流程時遇到的問題及解決的方法，現總結如下：
一、果蠅全基因組下載Fruit fly iGenome packages (Ensembl build; download via the TopHat and Cufflinks websites, along with packages for many other organisms; ）
注意：Drosophila_melanogaster\Ensembl\BDGP5.25下面有三個文件夾 分別是 Annotation、GenomeStudio、Sequence 其中Annotation/Genes/genes.gtf中是註釋文件 ，在
Sequence/BowtieIndex/genome.*是用Bowtie 建好的索引文件，以ebwt 結尾的文件，如果沒有，就要自己用bowtie -build 命令來建立索引文件。
二、Downloading sequencing data：Raw sequencing reads, aligned reads, assembled transfrags and differential analysis are all available through the Gene Expression Omnibus at accession GSE32038.
GEO 數據庫的有關介紹：Gene Expression Omnibus（GEO）數據庫
三、軟件的下載安裝，這裏的軟件大都可以直接下載解壓後，把其中的文件copy 到bin 目錄就好了，當然你也可以選擇自己重新編譯，但是會遇到各種問題（我沒嘗試過），Tophat 下載地址，cufflinks下載地址，例如cufflinks 下載解壓後 把下面這四個文件copy 到bin目錄下 。
四、Map the reads for each sample to the reference genome
說明： 1、這幾條命令中每條包含三個文件，gtf 文件，索引文件，和sequence（.fq） 文件
2、這裏的genome 就是上面說的Bowtie建立的索引文件
3、tophat參數詳解
4、最後三條命令出錯啦，用綠色把1改成2的部分
5、每個文件的路徑，如果不確定的話就用絕對路徑，這裏的這種寫法是這三個文件在同一個目錄下
五、
六、
七、
這一步容易輸出警告。
八、
這一步也容易出現問題，在SEQanswers上有詳細解答，詳見TopHat protocol error at cuffdiff。
