促進腦卒中患者運動功能的恢復，優化康復策略，與個體化預測的挑戰密切相關。經顱磁刺激（TMS）和腦電圖（EEG）的聯合應用已被證明能在個體水平上記錄局部和網絡反應。爲闡明TMS-EEG評估卒中後運動恢復的潛力，作者對28例卒中患者用神經導航的TMS-EEG對患側初級運動皮質(M1)進行了檢測。在卒中後的早期（6.7±2.5天），TMS誘發的EEG反應在患側M1區域上表現出兩種明顯不同的反應形態。在損傷較輕的患者中，TMS引起了分化和持續的EEG反應，並在兩側大腦半球均依次出現一系列偏轉。這反映了在健康對照組中觀察到的雙側激活模式。相比之下，在另一組受嚴重影響的患者中，TMS引起的局部反應緩慢而簡單。在時域和時頻域量化TMS-EEG反應顯示，與健康對照組相比，卒中患者表現出慢而簡單的反應和較高的振幅。重要的是，卒中後的這些活動變化模式不僅與最初的運動障礙有關，而且與卒中3個月後的運動恢復有關。因此，數據顯示腦卒中後早期運動網絡內的局部效應和因果關係嚴重受損。此外，對於MEP缺失和臨牀表型相同的嚴重受累患者，TMS-EEG提供了不同的反應模式，表明了個體功能恢復的潛力。因此，TMS-EEG支持評估個體反應特徵，擴展了腦卒中研究的方法範疇。本文由德國科隆大學學者發表在BRAIN雜誌。
小編注：TMS-EEG的實驗範式已經成熟，從檢測到治療都有對應的研究，本文作者利用TMS-EEG的一個基本優勢“它不依賴於皮質脊髓束或其他傳出和傳入通路的完整性，而是直接評估皮層的興奮性和活性”，通過最簡單的實驗範式，來評估TMS-EEG在卒中後運動功能恢復中的應用價值。雖然實驗過程簡單，但是作者分析的指標類型豐富，且都有利於得出文章主要想表述的結論，可見作者有深厚而紮實的理論功底。實驗中分析的指標和對其的解釋值得大家認真揣摩。
重要縮寫
ARAT=行動研究手臂測試；
ERSP=事件相關頻譜擾動；
LMFP=局部平均場功率；
MEP=運動誘發電位；
M1=初級運動皮質；
MSO=最大刺激器輸出；
NIHSS=美國國立衛生研究院卒中量表；
RMT=靜息運動閾值；
TEP=TMS誘發的EEG電位
方法
參與者
28名住院卒中患者[3名女性，25名右利手，平均年齡65.7±10.1歲範圍49-85歲]，由於首次缺血性卒中，有輕度到嚴重的運動障礙[上肢動作研究試驗(ARAT)：21.6±23.7；0-55；美國國立衛生研究院卒中量表(NIHSS)：8.3±7.1；1-36]。
根據以下納入標準納入患者：
(i)年齡在40至90歲之間；(ii)經彌散加權磁共振成像(DWI)證實的缺血性卒中；(iii)在亞急性早期階段，症狀出現<14天(卒中後6.7±2.5天；2-12天)；(iv)單側手運動障礙。定義年齡界限是爲了招募具有代表性的卒中患者樣本。
排除標準是：
(i)TMS的任何禁忌症(如癲癇、心臟起搏器)；(ii)雙半球梗死；(iii)腦出血；(iv)妨礙簽署知情書面同意的認知障礙或失語。參與者的上肢損傷範圍廣泛，嚴重或癱瘓的患者比例很高。12例患者上肢無殘餘運動功能。16例患者在TMS最大刺激輸出(MSO)時未檢測到MEP。25名患者在卒中後至少3個月(卒中後132.4±23.5天；99-183天)進行重新評估。
15名年齡匹配的健康參與者，無任何神經或精神疾病史(2名女性，14名右手使用者，平均年齡62.2±13.0歲;51 -76)作爲對照組。
表1 參與者信息
運動測試
我們在每個階段評估四個運動和臨牀參數：
(i) NIHSS對全局神經損害進行評級；
(ii)運動指數，對手臂和腿部近、中和遠端關節的肌肉力量進行分類；
(iii) ARAT，評估粗大和精細的上肢功能；
(iv) 在連續三個試次中使用握力計分別評估每隻手的最大握力。
爲了進一步分析，我們計算了一個握力指數，代表卒中患者相對於健手的相對握力：
平均握力(患手)/平均握力(健手) x100
TMS-EEG數據記錄
TMS使用Magstim Super Rapid2刺激器。配備Magstim 70毫米8字Alpha膠片線圈。使用無框架計算機化立體定位神經導航系統(BrainSight V.2.0.7)跟蹤和記錄線圈的位置。（TMS應用於患側初級運動皮質(M1)。患側M1的“運動熱點(motor hotspot)”被定義爲與顱骨呈45°前後方向相切的TMS脈衝的反應，誘發癱瘓手部第一骨間肌肉(FDI)振幅最高的運動誘發電位(MEP)的線圈位置。這種定向在中央溝前壁(相當於中央前回的後壁)的神經元處誘發垂直電流，並優先跨突觸激活皮質脊髓系統）
TMS誘發的EEG電位使用TMS兼容64通道EEG系統記錄。放大器可防止磁飽和(saturation)，並允許在施加TMS脈衝期間連續記錄數據。腦電信號採樣率爲5 kHz，分辨率爲0.1 mV/bit，濾波爲高通0.1 Hz和低通1kHz。頭皮EEG採用62個與TMS兼容的Ag/AgCl電極，安裝在彈性電極帽上，按照標準佈局和國際10-20系統進行記錄。64通道系統中剩餘的兩個電極被用來記錄水平和垂直眼球運動以及眨眼，方法是將一個電極放在左眼外眼角旁邊，另一個電極放在右眼下面。
爲了優化TMS的兼容性，在整個實驗過程中，所有電極的阻抗都保持在5kΩ以下。此外，爲了防止EEG聽覺誘發電位以及TMS點擊引起的眨眼或眼肌反應，參與者佩戴了插入式耳塞。在TMS線圈和腦電極帽之間放置了一層薄薄的塑料膜使TMS產生的骨傳導最小化。（小編注：很好的實驗指導方案）
實驗程序
在每次TMS-EEG之前，評估患側M1的“運動熱點”、MEP狀態以及隨後的靜息運動閾值(RMT)。重要的是，在放置腦電極帽之前確定患者的MEP狀態和RMT。然而，由於腦電極帽可能會因爲線圈-皮層距離的增加而增加誘發MEP所需的強度，所以在帽後確認或調整RMT。MEP狀態通過逐漸增加刺激強度來分類，直到在10個試次中至少有5個試次可以在靜止狀態下以一致潛伏期誘發任意幅度的MEP。如果沒有得到符合這些標準的應答，即使是100%的MSO，患者也被歸類爲MEP陰性。在可檢測到MEP的情況下，用MEP波幅評估患側M1的皮層興奮性。爲此，在0.2Hz的頻率下，用110%的個體RMT誘發10個MEP。如果我們即使在MSO(n=16)的情況下也不能在同側大腦半球誘發MEPs，則使用對側RMT作爲個體閾值的參考。
這一過程背後的基本原理是爲了避免由於損傷誘導的斷開效應而導致的虛假的高刺激強度，而不是降低的M1神經元興奮性。此外，先前的研究表明，儘管患側大腦半球的皮質運動興奮性隨卒中後的時間和運動損傷的程度而變化，但對側興奮性隨着時間的推移保持相對穩定，並且與健康參與者沒有不同。如果在患側半球上檢測不到MEP，則使用解剖學標誌，即hand knob，來定義患側運動熱點。
在EEG記錄過程中，將至少100次單TMS脈衝施加於患側M1的運動熱點，隨機間隔爲6.5-8.0s，強度爲RMT的80%，該強度高於EEG反應閾值。此外，閾下刺激強度限制了傳入的軀體感覺反饋，這是已知的對EEG反應的影響。在TMS-EEG記錄期間，參與者坐在舒適的椅子上，並被要求保持清醒，睜着眼睛。12例因軀幹無力而不能坐在椅子上的重傷患者，在牀上觀察頭部傾斜45°，清醒，睜開眼睛。
數據分析
使用MatLab R2017b和EEGLAB進行數據預處理和分析。目測腦電對TMS的反應，以排除單一試次和單一通道的人爲干擾。每名參與者至少有90次無僞跡試次用於進一步分析(無僞跡單項試次數：患者：96.8±10.4，健康對照組：97.5±25.0；內插通道數：患者：5.0±1.4，健康對照組：3.9±2.0)。消除相對於TMS脈衝起始的-2ms到10ms之間的TMS僞跡。缺失的數據使用基線替換。隨後，對數據進行去線性趨勢、帶通和帶阻濾波(1-60 Hz；49-51 Hz；Butterworth三階)，降採樣至625Hz，並在TMS脈衝-1000ms至+1000ms的時間窗口進行分段。對壞通道進行球形插值。採用全腦平均進行重參考並進行基線校正。使用EEGLAB函數runica進行獨立成分分析，去除與TMS相關的其他僞跡以及眼動或肌電僞跡。
爲了比較患者和對照組患側M1的局部TMS誘發的腦電活動，我們首先計算了局部平均場功率(LMFP)，它將誘發電場量化爲時間的函數。基於7例腦卒中患者（圖1和圖2）的簡單雙相慢波和持續100ms的大正波的TMS-EEG反應形態，選取兩種時間窗內的數據進行後續分析，早期時間窗在+10~+100ms之間，晚期時間窗在+100ms~+200ms之間。
LMFP（局部平均場功率）：最接近刺激部位的感興趣區域(ROI)通道(M1爲FC3-FC1-C3-C1-Cz/FC4-FC2-C4-C2-Cz)的TEP平方均值的平方根。然後對LMFP時間序列應用Bootstrap統計(排列數量=1000，α<0.01)，以估計與基線(-300ms至-50ms)有顯著差異的LMFP值。我們計算了刺激後平均在+10ms到+100ms和+100ms到+200ms之間的顯著激活積分。這兩個時間段是基於卒中患者的TMS-EEG簡單陽性反應(圖1和圖2)選擇的。
圖1 代表性被試對M1刺激的TMS-EEG反應
(A)健康被試。(B)卒中患者。頂行：病變位置。中間行：代表全部62個腦電電極的蝶形圖(粗線：刺激電極/C3)。下排：TMS誘發反應的地形圖。
圖2 無誘發MEP患者亞組的不同TMS-EEG反應
卒中後早期無MEP的所有患者(n=16)刺激的患側運動皮質的TMS-EEG反應。灰色條表示99%置信區間。在TEP曲線圖旁邊，顯示了各個患者的相應運動評分。此外，單個彌散加權磁共振成像的冠狀位切片顯示急性缺血性病變。注意，顳葉的雙側高信號是由易感性僞跡引起的
此外，爲了量化健康參與者的高頻復現波和患者的低頻復現波的不同反應模式，我們考慮了顯著偏轉的數目作爲參考。因此，我們使用bootstrap對刺激前的活動進行了研究，確定了個體被試水平刺激部位下的平均TMS-EEG反應的顯著性閾值。
通過基於Morlet小波變換的事件相關頻譜擾動(ERSP)計算，得到了時頻域的頻譜特徵。在年輕的健康對照者中，TMS誘發的腦振盪活動的主要頻率是特定於刺激部位的。然而，即使不是直接刺激，每個皮層區域也會以從快到慢、從rostral到後腦區的梯度振盪，接近其固有頻率。因此，我們從患側運動皮質、患側前額葉皮質和患側頂葉皮質三個不同部位提取了刺激患側M1時的固有頻率，即最大功率頻率。
固有頻率分析：採用Morlet小波變換(3.5個週期)時頻變換後，通過計算事件相關頻譜擾動(ERSP)來評價頻譜特徵。該過程是通過使用EEGLAB函數newtimef實現的。在單試次水平應用絕對頻譜標準化，首先執行全長度單試次校正，然後對所有試次的平均ERSP進行刺激前基線校正(-500ms至-100ms)。最後，只有在基於引導的統計數據。排列數量=1000，α水平<0.05)中存留下來的相對於基線的顯著ERSP值被考慮用於進一步分析。我們在5-50Hz頻率範圍和刺激後20ms-200ms之間的時間窗口內對ERSP進行平均，以最大限度地減少刺激時可能出現的僞跡的影響。
統計分析
使用SPSS進行統計分析。使用單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗，首先驗證變量是否服從正態分佈，以決定參數或非參數統計量。相應地，採用重複測量方差分析和事後t檢驗或非參數Mann-Whitney U檢驗進行顯著性差異評估(P<0.05)。此外，爲了說明非參數統計中的交互效應，我們計算了對齊和秩變換的數據的重複測量ANOVA。
爲了闡明組間的顯著差異是否依賴於最初的運動症狀嚴重程度，我們使用2Dk-Means聚類，通過早期亞急性階段的ARAT和相對握力評估，將運動損傷分組，分爲輕度損傷(n=6)、中度損傷(n=7)和重度損傷(n=15)三組。
用k-means聚類分析將亞急性期早期的ARAT評分和握力指數分爲三類，分別反映輕度(ARAT的聚類中心爲45.9，相對握力爲79.8%)、中度(ARAT的聚類中心爲37.0，相對握力爲44.8%)和重度運動損害(ARAT的聚類中心爲1.1，相對握力爲3.4%)。在這個組分類的基礎上，隨後使用單變量方差分析和Kruskal-Wallis檢驗來揭示組間差異。
最後，檢驗觀察TMS-EEG活動變化是否與初始臨牀損害或卒中3個月後的運動恢復有關。我們使用主成分分析(PCA)計算卒中後第一天的運動綜合評分：
(i) 患側手的ARAT評分；
(ii) 相對握力；
(iii) 患側手臂的運動指數評分。
NIHSS評分沒有包括在內，但用於測試與全局神經損傷的相關性。
爲了生成綜合恢復分數，我們首先計算每個感興趣的參數(即ARAT、握力和運動指數)在第一次測試和後續測試之間的相對差值:
d(x，y)=(x-y)/1+y
其中d=差值分數；x=時間點1的分數；y=後續的分數
隨後，將z標準化的差值再次輸入PCA，其中第一個分量代表上肢的運動恢復。我們還測試了MEP狀態與初始損害和恢復之間的關係，以闡明TMS-EEG反應是否增加了MEP的預後價值，特別是對於MEP陰性的患者。以綜合康復評分爲因變量，初始運動綜合評分、MEP波幅或TMS-EEG參數爲自變量進行線性迴歸分析。
由於初始功能損傷會對恢復效果產生影響，因此進行相關分析以說明初始損傷的部分相關。事後檢驗和相關性才用FDR進行多重比較校正。
基於體素病竈映射(VLSM)
爲了評估刺激效應是否與病變部位相關，我們用非參數製圖(NPM)軟件根據DWI病變範圍進行了基於體素病變症狀映射(VLSM)。對於所有中風患者，在中風後的前兩天內，使用1.5T飛利浦磁共振掃描儀在臨牀獲取磁共振圖像標準序列（DWI，T2-加權，T2*加權，FLAIR和血管造影序列）。基於彌散加權成像（DWI）（TR=3900ms，TE=95ms，FOV=230mm，22個軸位，體素大小：1.8x2.99x6 mm3），使用MRIcron軟件創建單個病竈圖。使用NPM進行了VLSM。只有在至少10%的患者中受損的體素被納入分析。我們使用推薦用於中等樣本量的非參數置換試驗（2000置換）進行多重比較矯正。
結果
大腦皮層興奮性
與健康人(55.0±11.2%MSO)相比，亞急性期和大於3個月的患者患側大腦半球RMT均明顯增高。患者的RMT從卒中後第1周至卒中3個月後顯著下降。
然而，在沒有MEP的情況下，即使在最大MSO的情況下，對側M1也可以作爲用於TMS-EEG的個體閾值的參考。重要的是，患者和健康對照組之間的實際平均刺激強度沒有顯著差異。因此，不同羣體之間的差異不能用刺激強度的差異來解釋。
卒中後TMS誘發皮層活動的特徵
評估卒中後2周內卒中患者TMS誘發的腦電，發現TMS觸發的反應形態主要有兩種截然不同的性質(圖1)。在大多數（21名）患者中，TMS在刺激後的300毫秒內，在雙側大腦半球引起一系列正負偏轉，並與快速變化的雙側大腦半球激活模式相關，可與健康對照組中觀察到的反應相媲美。相比之下，在7名嚴重患者的亞組中，M1上的TMS引起了緩慢的、強烈簡化的、高振幅的雙相反應。這個大的波形持續了約100ms，進一步的TMS鎖定活動幾乎消失。此外，誘發活動僅侷限於患側M1刺激部位下。
這些不同的TMS-EEG反應模式，即簡單的雙相模式和更具差異性的模式，也可以在沒有誘發MEP的患者亞組中被識別(圖2)。因此，TMS-EEG能夠揭示無殘餘運動功能並嚴重破壞皮質脊髓完整性的患者的不同運動皮層特性，如MEP缺失。
卒中與早期TMS-EEG反應相關
爲了量化健康參與者與患者之間以及患者亞組(輕度、中度、重度)之間的差異，我們首先比較了TMS-EEG反應的LMFP對涉及高振幅特徵的刺激患側運動區的影響。結果發現，與健康對照組相比，卒中患者的腦電反應較大，有統計學差異。組間t檢驗顯示，卒中患者在持續到100ms的早期具有較高的TMS誘發反應，但在刺激後的晚期則沒有組間差異(圖3)。當根據患者最初的運動障礙將患者分爲重度、中度和輕度影響組時，這一發現也同樣明顯。尤其是重度和中度腦卒中患者刺激後早期TMS誘發活動明顯高於健康對照組。
與健康對照組相比，患者表現出更多的簡單TMS反應。按損傷分組時也檢測到組間差異。事後檢驗顯示，與健康對照組相比，重度損傷組患者對TMS的皮層反應更爲簡單。
圖3 通過LMFP對患側運動區的TEP進行比較
(A)1例典型腦卒中患者和1例健康對照參與者的TMS誘發EEG反應的所有通道(粗體通道代表感興趣區)的蝶形圖；
(B)相應的LMFP，具有兩個相應的時間間隔(10-100ms；100-200ms)。
(C)健康參與者和卒中患者組的LMFP條形圖。
(D)所有卒中患者和健康參與者的總平均LMFP。虛線表示TMS脈衝的定時。
卒中後早期TMS誘發振盪的主要頻率發生改變
爲了捕捉腦卒中患者TMS誘發腦電反應的慢特徵，我們從TMS患側M1的三個皮質部位提取了TMS誘發腦震盪活動的主頻：患側前額葉、運動區和頂葉皮質。對排列的秩變換數據進行重複測量的方差分析顯示，部位(三個水平：前額葉、運動區、頂葉)´分組(兩個水平：患者、對照組)的交互作用顯著，表明不同解剖區域誘導的固有頻率存在差異。事後檢驗顯示，健康參與者和卒中患者在前額葉和運動區有顯著差異，但在頂葉區域沒有顯著差異。健康對照組在rostral有更多的更高頻率的前後梯度，在枕區出現更多的低頻振盪。ERSP（事件相關頻譜擾動）分析證實，卒中患者的運動和前額葉區域也有慢頻譜特徵(圖4)。此外，患者亞組間的這些差異也很明顯。受影響嚴重的患者表現爲與前額葉和運動區的TMS相關的皮層反應遲緩。
圖4 使用ERSP比較固有頻率
一名典型卒中患者和一名健康對照參與者的TMS誘發腦電反應，如蝴蝶圖所示。蝴蝶地塊中的紅色通道突出了感興趣的區域，即前額葉、運動區和頂葉。相應的ERSP模式(在5至50 Hz之間)在其下方。請注意，紅叉表示ERSP分析的感興趣區域，而不是刺激部位，因爲刺激部位通常是患側運動皮質。每個ERSP右側繪製的灰度圖顯示了TMS發作後20-200ms期間的功率譜分佈。虛線表示功率最大的頻率，即固有頻率。右側面板顯示每個分析區域的平均固有頻率條形圖。
運動誘發電位、初始損傷和恢復
總的來說，患者通過NIHSS的降低和所有行爲評分的增加，經歷了實質性的康復。值得注意的是，嚴重損害組(n=14)中所有MEP陰性的患者，也表現出恢復。這14名患者中有9名（64.3%）表現出某種程度的康復。
初始運動綜合評分與RMT呈負相關，與MEP波幅呈正相關。因此，更嚴重的運動障礙與更高的RMT和更低的MEP振幅有關。然而，這兩個參數都與運動恢復無關，也與MEP陰性的患者（28例中的16例）中的NIHSS指數的一般恢復無關。重要的是，當使用MEP狀態，即MEP的存在或不存在，而不是MEP幅度時，產生類似的結果。同樣，線性迴歸分析顯示，僅對於MEP陽性患者的子集，MEP振幅與初始運動綜合評分相結合可以解釋綜合運動恢復評分觀察到的方差的81.8%。相比之下，當考慮所有卒中患者時，相同的模型未能預測康復。因此，尤其是嚴重功能障礙和MEP缺失的患者，其恢復情況無法預測。
TMS-EEG初始損害及恢復的關係
我們測試了觀察到的TMS誘發腦電活動的改變是否與卒中的初始損害或運動恢復3個月後有關。在卒中後早期，患側M1低頻振盪的TMS-EEG顯著改變和偏轉的數目與最初的運動障礙有關(圖5A)。因此，根據運動綜合評分，分化程度較低且頻率較低的EEG反應與較強的運動功能障礙相關。此外，第一次檢查時的NIHSS分數也發現了這兩種相關性。
圖5 相關分析
我們隨後測試了TMS誘發EEG和恢復之間的關係。我們發現卒中後最初幾天評估的腦電反應的偏轉次數與綜合康復評分所反映的較好的運動恢復之間存在正相關。在卒中後的最初幾天，以簡單、緩慢、振幅高的TMS誘發反應爲特徵的患者表現出較差的神經學結果。重要的是，TMS-EEG特性與康復之間的這種聯繫在臨牀和電生理MEP陰性和嚴重損害組中得到了證實，進一步強調了TMS-EEG在卒中患者中的有效性。
對於所有卒中患者，以綜合康復評分作爲結果變量，以初始運動綜合評分作爲唯一預測因子的線性迴歸分析顯示，初始損傷只能解釋11.1%的方差。相比之下，將TMS-EEG參數(LMFP、偏轉次數和患側M1的固有頻率)作爲自變量加入到模型中，分析表明51.7%的方差可以解釋。值得注意的是，如前所述，使用初始運動綜合評分和MEP波幅的等效模型在我們的腦卒中患者隊列中沒有產生對綜合運動恢復評分的顯著預測。
腦卒中病竈的影響
個別病竈位於基底神經節，即內囊、殼核後肢及丘腦部分部位(圖6)。
圖6 VLSM病竈
(A)腦卒中患者最大病竈位於基底神經節。
(B)與TMS誘發的早期增強LMFP相關的病竈。
(C)與TMS-EEG反應偏轉次數減少有關的病竈。
(D)與固有頻率變化相關的病竈。
損傷體積與TMS誘發的EEG反應無關，也與中風引起的腦損傷和隨後的恢復無關(p值均> 0.2)。相比之下，增強的早期TMS誘發的EEG活動(LMFP)的VLSM顯示與內囊和尾狀核的病變有關（P<0.05，FDR在體素水平矯正）。相比之下，單純的TEP模式和固有頻率的降低與放射冠皮層下白質的病變有關(P<0.01, FDR校正)(圖6)。因此，慢波特徵主要與皮質脊髓束的病變有關。因此，中風引起的腦電反應的改變似乎與連接受損而不是M1神經元的主要功能障礙有關。
總結：
作者在28名不同損傷程度的腦卒中和15健康參與者之間的TMS-EEG實驗中，使用LMFP（局部平均場功率）、偏轉次數和患側M1的固有頻率等指標，測試了TMS-EEG評估卒中後運動恢復的潛力，並探測其餘損傷恢復之間的關係。結果發現，TMS-EEG能夠探測到不同損傷程度的腦卒中患者的皮層特性，卒中後最初幾天評估的腦電反應的偏轉次數與綜合康復評分所反映的較好的運動恢復之間存在正相關，本研究爲腦卒中研究提供新的思路。
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