100多年前，Ramon y Cajal提出假設，在哺乳動物大腦連接的進化過程中，有兩種力量在起作用：最大限度地降低連接成本和最大限度地提高傳導速度。利用擴散張量MRI，本文作者重建了123種哺乳動物的大腦連接體。網絡分析顯示，哺乳動物的連通性和連接成本都是守恆的。作者的結果描述了保持大腦整體連接的守恆原則：半球間連接較少的物種表現出更好的半球內連接。
結果表明，有些物種的大腦半球間連接更多，半球內連接更少，反之亦然。同樣的模式也適用於物種間，包括人類(人類的MSP與連合比例的斜率與所有哺乳動物沒有區別)。本研究在探究哺乳類動物大腦的結構連接的連接成本和連接效率方面平衡方面存在跨物種和物種內部的一致性方面做出了巨大的貢獻。
研究背景：
哺乳動物的大腦是物種進化過程中最複雜的生物系統之一。以前大多數對哺乳動物大腦的比較研究都集中在灰質，但是大腦連接體（即白質連接）的完整網絡——對大腦功能的重要性與神經元一樣，但只有少數研究使用物種間比較的方法考察了它的演化。本文利用擴散張量成像技術研究了123種哺乳動物的宏觀白質連接，這123種哺乳動物來自12個不同的哺乳目種屬（具體見圖1a），這些動物的腦容量從小於0.1ml到大於1000ml都有。在所有物種中，都利用大腦體積對大腦體素的大小進行歸一化，使得最終所有大腦獲得的體素數量都差不多。
從以往研究的觀點看，引導連接體進化的主要因素之一是快速信息傳輸和連接成本之間的權衡。一方面，爲了更高的連通效率，需要更多更長的連接（爲了能夠形成小世界網絡，不僅需要近距離節點間的連接，也需要大量遠距離節點間的連接以能夠更快的完成遠距離通信），但另一方面，它們增加了連接成本（這主要是因爲連接更長時，信息傳輸所需要的能量就更大，消耗會增加更多，提升通信成本）。爲了驗證這一點，本文首先使用網絡的平均最短連接(Mean short path，MSP)量化了哺乳動物之間的連通性，這是一種衡量全腦網絡通信的方法。MSP反映了網絡的兩個節點之間通信需要的最小步驟數(連接)。之所以採取MSP指標，是因爲該指標與連通性成反比，即MSP越高，連通性越低。
儘管哺乳動物的大腦大小和形狀存在巨大差異，但全腦連接性是如何保持的呢?哺乳動物的宏觀連接體大致可分爲兩個半球網絡，它們通過連合纖維相互連接，並通過半球內聯合纖維相互連接。連合纖維的數量和排列在哺乳動物中差異很大。當觀察到大腦之間的整體連接是恆定的(圖1c和補充圖2)，作者假設，連接較少的大腦半球內網絡必須以某種方式進行調整，以允許整體上相似的連接。需要注意的是，在這個部分的假設驗證中，作者檢查的是半球內的MSP，而不是之前圖1中使用的全局MSP。重要的是，因爲本次研究總是在所有物種中隨機取樣4000個半球連接(見方法)，而且因爲所有網絡都有相同數量的節點(200)，所以在半球內MSP中觀察到的任何變化都應該反映半球連接的實際變化。
圖1 跨物種哺乳動物的全腦連通性
註釋：圖a：MaMI數據庫包括123種物種的掃描結果。括號內的數字表示對一些物種的多個個體進行了掃描;
圖b：在對數尺度上，白質(WM)體積與灰質體積呈線性相關，其斜率係數爲~1.19 (P <10 -10，皮爾遜相關檢驗;n = 232)。
圖c：全腦MSP與對數尺度的腦容量具有顯著的相關(P <10 -6, Pearson s相關，n = 232)。MSP是在加權網絡(以1/經過的纖維數目)上計算的，因此實際的MSP值是在議定標度上表示的。相關P值的報道沒有進行系統發育校正。
圖d：所有哺乳動物的半球MSP與連合纖維的比例顯著相關(n = 232)。六名人類被試被標上了藍色的圓圈。圖e的數據和d是一致的，但e標註了不同屬目動物的顏色，可以看出同一屬目的距離更近，帶顏色的陰影部分是95%置信區間。
圖f：半球(橙色)和全腦連接(黑色)成本與對數尺度的腦體積相關檢驗結果(Pearson s相關性，R2 = 0, P = 0.58, R2= 0.03, P = 0.008，分別爲半球和總網絡;n = 232)。全腦連接成本的相關性是顯著的，但可解釋的方差變異是很小的。
補充圖2 在所有跨物種哺乳動物中網絡連接最短路徑的分佈
註釋：縱座標是在對數尺度上按照大腦總體積大小排序的不同物種的腦容量，橫座標是全腦最短路徑數目，color bar代表的是在該體積下，最短路徑長度數目最常出現的比例，顏色越淺代表越典型。
研究方法：
樣本：
哺乳動物MRI (MaMI)數據庫包括123種不同物種的彌散掃描和T2-/t1加權掃描，其中一些物種的樣本達到了232個大腦(補充表1)。本次研究獲得了儘可能多的樣本，遠遠超過以前的比較方法的研究。所有的掃描(除了人類參與者)都在切除和固定的組織上進行。掃描使用7-T 30/70 Biospec Avance Bruker系統或3-T西門子Prisma系統。所有符合7-T口徑的大腦都被掃描，而較大的大腦則被3-T掃描儀掃描。本研究未對動物實施安樂死。腦的收集是基於以色列動物園的偶發死亡動物和國外收集的自然死亡動物。所有的動物都得到了國家公園管理局的許可(批准號:2012/38645)或在相關國傢俱有同等的許可。動物的大腦在死亡24小時內被提取出來，並置於甲醛(10%)中固定幾天到幾周(取決於大腦的大小)。在磁共振成像前24小時，大腦被放置在磷酸鹽緩衝鹽水中。在MRI中，大腦被放置在一個塑料盒中，浸泡在含氟油(氟化油，3 M)中，這個過程是爲了儘量減少磁敏感效應造成的圖像僞影。
MaMI數據庫包括5名人類(3名男性和2名女性)，用於所有哺乳動物的比較分析(如圖2a所示)。爲了進行物種內的比較(圖3)，作者還使用了一個包含22名人類的額外數據庫(11名女性和11名男性，平均年齡爲37.9歲)。沒有使用統計方法來預先確定樣本量，但本研究的樣本量與之前的報道相似21。所有受試者(共計27人)神經健康，並簽署了一份由Sheba Medical Center審查委員會和特拉維夫大學倫理委員會批准的知情同意書。分析流程與MaMI數據庫中使用的流程類似。
MRI採集：
所有物種的MRI掃描方案相似，包括高分辨率解剖掃描(T2或t1加權MRI)，用於解剖參考，以及擴散MRI掃描。包括高角分辨率彌散成像(HARDI)採集。HARDI數據集包括一系列覆蓋整個大腦的擴散加權、自旋迴波、回波平面成像圖像，分別在60個(在7-T掃描儀中)或64個梯度方向(在3- t掃描儀中)進行掃描，另外還有3個非擴散加權圖像(B0)。所有掃描的b值均爲1000s mm2。7T的掃描機器,TR超過12000毫秒(取決於採集切片的數量),TE 20 ms和Δ/δ= 10/4.5 ms。3t的掃描,TR 3500 ms, TE 47ms士和Δ/δ= 17/23ms。保持所有物種的矩陣大小不變(128*96)，對二維圖像的像素分辨率(每個切片)根據大腦的大小進行線性縮放。作者進行了對照分析，以確保這個操作不會影響結果。腦切片的數量因腦形狀的不同而不同，在46到68之間。不同物種的掃描重複次數和獲取時間不同，取決於腦大小和信噪比。作者試圖保持SNR>20，導致小的腦採集需要48h (~0.15 ml)，大腦採集則約25min (~1000 ml)。信噪比被定義爲大腦的平均信號強度除以噪聲的sd.(圖像非大腦部分的區域)。
DTI數據分析和白質追蹤
作者使用ExploreDTI 22軟件進行HARDI/DTI分析以及後續的全腦白質纖維重建。以下步驟用於生成纖維束：
1) 各向異性平滑(使用3像素高斯核)，以降低噪聲和平滑數據。
2) 運動和畸變校正:對運動、磁化率和渦流畸變在HARDI採集的個體空間進行校正。
3) 利用約束球形解卷積（CSD）方法生成了每像素的纖維定向密度函數，提供了每個體素可能的多個(n >= 1)纖維定向。使用了四階以下的球面諧波。在使用傳統的基於DTI的數據的tractography時驗證了這一結果。
4) 使用對所有樣本相似的CSD種子點閾值(0.2)和步長爲像素大小一半的步長進行全腦的tractography。
這一步的輸出是一個纖維束列表(估計的纖維束)，起始和結束於任何體素(包括它們的完整軌跡)。所有能被掃描的大腦都在接下來的分析中被使用，沒有被排除的數據。
白質網絡的生成的分析：
由於本次研究僅對大腦內部的連接感興趣，每個大腦的外部投射纖維(即穿過腦幹的纖維)和小腦連接都被手工移除。其他的半球內投射纖維(如丘腦輻射)也包括在分析中。人工標記大腦中線，將大腦束分爲左半球、右半球和半球間束三組。
爲了將大腦分割成200個節點，所有的纖維端點(x y z)位置被用作k-means算法的輸入。k-means算法相對於隨機節點劃分的優勢在於，具有類似連通性配置文件的頂點將被分組在一起。k-means算法在處理未連接的網絡組件時也有幫助。每個半球執行兩次。將200個集羣中的每個集羣的中心作爲網絡中的一個節點。先前的研究已經表明，纖維的跟蹤會導致偏誤，因爲纖維的絕大多數端點位於白質中。
本文的跟蹤方法(包括對HARDI數據集的CSD跟蹤)確保絕大多數跟蹤端點(~90%)位於皮層或皮層下灰質(參見補充圖12中的示例)。每個半球隨機選擇4000根纖維(從全部纖維束列表中)來計算網絡的邊緣。在所有物種的每個半球上使用固定數量的纖維，以避免由於纖維數量的不同而產生的偏差。接下來，生成一個連通性矩陣來索引任意兩個節點之間的纖維連接數。
重複上述步驟100次，每次每個半球隨機選擇4000根纖維(作者的額外分析證實改變這個數目不會影響結果）所有的網絡分析都進行了100次，然後取平均值。利用每個半球的連通性矩陣來計算半球內的MSP(MSP，mean short path，平均最短路徑，分別對左右半球的網絡進行估計並求平均)。使用每條纖維的端點作爲節點時，網絡中最大的連接組就是整個網絡。此外，還計算每個節點對之間的平均距離(束長)作爲連接兩個節點的所有纖維的平均距離。該纖維長度還用於計算每個大腦的連接成本指數(連接矩陣和整個大腦中採樣的4000個連接的長度矩陣相乘的總和)。需要注意的是，作者從所有物種中採樣的纖維數量是相等的，儘管在現實中，這個數量可能不會在物種間保存。因此，本文的連接成本計量可以認爲是常數數量的纖維的成本。數據的分析和收集不是分開進行的，因爲沒有對數據進行分組。
補充圖12 本次研究中白質纖維追蹤的端點分佈示意
對掃描分辨率和採集參數的控制：
由於本次研究的掃描在所有物種中保持矩陣大小恆定，體素的維度與大腦體積成線性比例。這導致了不同樣本的掃描分辨率。因此，作者進行了幾項分析來驗證這是一個合理的決定，包括:
(1) 比較基於dti的腦連接體和使用HARDI方法產生的家鼠的連接體的差異。兩個網絡之間的強相關性表明本文的方法可以重建連接體的本質(補充圖13)。
(2) 以多種分辨率掃描了九個物種的大腦，可以在相對分辨率下進行分析比較
(3) 多種分辨率的分析發現，可以重建大腦中特定的纖維系統，這些纖維束的大小與大腦體積成比例。
(4) 分析了大腦中纖維交叉對結果的影響。
(5) 最後，對於4個以上標本的物種，分析發現連通性守恆原理在物種內部也存在，其絕對分辨率幾乎相同(圖3)。
小鼠腦白質連接體的重建：
使用艾倫鼠連接數據創建了一個追蹤連接體，它可以與基於DTI數據追蹤的連接體進行比較。爲了在同一圖譜座標系統上對齊兩個連接體，使用了一個被分割成20個皮層和皮層下區域的小鼠大腦圖譜(補充圖13a)。艾倫鼠連接性圖譜（補充圖13b）的每個投射位點都被確定並分配到這20個區域。根據Allen鼠連接數據，將每對區域之間連接的權重定義爲連接強度的總和。對於基於tractography的小鼠連接體，使用了配準到同一圖譜後作爲數據庫一部分的小鼠數據。連接體中的連通性權重被定義爲每對區域之間經過的白質連接數。兩個連接體如補充圖13b,c所示。Mantel ’s檢驗各矩陣間相關性極顯著(P = 2.3 *10 -4)。
補充圖13
對交叉纖維的定向分析：
爲了解決多條纖維（這裏指一個體素中多條纖維穿過）的定向問題(multiple fiber-orientations ，MFOs)，作者使用了約束球形解卷積的纖維跟蹤方法（CSD方法）。利用這種分析，可以計算MFOs的體素相對於腦容量的比例。發現MFOs的比例與大腦體積呈線性關係，這表明大腦越大，交叉纖維越多。然而，本文使用的兩種纖維追蹤方法(CSD和傳統的DTI)都揭示了相同的守恆原理(比較補充圖8a和圖2)，儘管第一種方法可以揭示交叉光纖，而第二種則不能。這表明，纖維交叉的問題不能解釋本文的主要觀察結果。
估計連合纖維的比例：
對每個大腦，連合纖維被識別(僅主要的三個系統：胼胝體、前連合和海馬連合，在所有哺乳動物中佔絕大多數)。這是通過在正中矢狀平面上放置一個感興趣的種子區域來實現的。用這種方法得到的纖維數除以纖維總數，得到連合纖維的比例(連合比例)。由於這一比例可能會因跟蹤參數而有所偏差，通過將連合系統(人工分割)的正中矢狀面積(平方根)除以大腦體積(立方根)來計算連合比例的額外估計。
灰質和白質體積的計算：
當我們掃描沒有頭骨的大腦時，大腦的總體積是通過將噪聲閾值以上的體素數量乘以圖像分辨率來計算的。爲了估計灰質和白質體積，將各向異性的圖譜輸入高斯混合模型分析，將體素分爲三個組織(白質、灰質和腦脊液)。爲了估計白質和灰質體積，體素(屬於這兩種組織類型)的概率在整個大腦中求和，並乘以圖像分辨率。一個例外是人類大腦掃描(在體內進行)，SPM12用於執行顱骨剝離和分割，以創建一個大腦mask來計算灰質和白質體積。
控制節點的數量：
在本研究中，作者將大腦分成每個半球100個節點。爲了驗證節點的數量對結果沒有影響，多次運行了本文所描述的網絡分析，同時將大腦分割爲不同數量的節點，從50到400，每次以50遞增。然後比較了不同節點下的結果。
統計分析：
所有統計分析均使用Matlab 2018 (Mathworks)進行。使用皮爾森相關係數來關聯各種網絡(例如MSP)和大腦參數(例如腦容量)，使用P<.05爲顯著性水平。所有檢驗都是雙尾的。沒有對數據的正態性進行測試，因爲對於像這樣的大樣本容量來說，這是不需要的。由於沒有對樣本的系統發育依賴進行校正，本文還對所有哺乳動物目進行了皮爾遜相關性分析。爲了控制重複(同一物種的多個標本)，使用GLM來檢驗半球形MSP和連合比例之間的關係。以連合比例和腦容量爲固定解釋因子，設定MSP爲被解釋變量（即因變量），進行GLM運算。使用Chow’s檢驗來比較人類和所有哺乳動物中MSP與連合比例迴歸的係數。沒有使用任何隨機樣本檢驗的方法，因爲除了根據它們的系統發育順序外，數據沒有進行任何分組。
研究結果：
總體來說，本次研究的結果表明了一種跨物種屬目的哺乳動物大腦的連通性守恆原理，即半球間連接較少的物種，其半球內連通性更好(圖1d;連合纖維的比例與腦內MSP之間有很強的相關性，與腦容量無關）。以半球內MSP爲因變量，以連合比例和腦體積爲固定預測因子的廣義線性模型(GLM)的分析表明，半球內連接彌補了較差的半球間連接，保持了整體連接。重要的是，連合纖維的比例和半球內MSP是獨立測量的，因爲前者是在包括所有重建束的原始數據上測量的，而後者是在半球網絡上估計的。此外，利用其橫截面積估計的連合比例也得到了同樣的結果，即不使用纖維跟蹤算法時也得到了相通的結果(補充圖 4)。
除此以外，作者還通過額外的分析方法證實了這種守恆現象與纖維追蹤方法以及纖維數目的約束、種子點的約束這些分析方案是無關的，這種結果在不同的掃描過程、不同的網絡重構和加權參數下都獲得了類似的結果(補充圖5 -11，這些圖大家可以在補充材料中獲取和查看，不是文章的主要部分，爲了不影響閱讀的連續性，這裏不再一一列出)。
補充圖4 半球MSP與連合纖維比例的相關
註釋：作者這裏用連合纖維橫截面的面積的平方根除以腦體積的立方根來估計連合連接的比例。與主圖2不同的是，這裏沒有用纖維跟蹤來估計連合連接的比例，而只用面積測量，所以這裏的結果與跟蹤算法的參數無關。R2=0.24 (Pearson相關，p<10 -13, N=232)。
總體發現，哺乳動物的大腦包括五個半球間連合纖維系統，其中主要的三個是胼胝體、前連合和海馬連合。這三種纖維系統之間的半球間連接的劃分具有很強的種特異性。本次發現的保護原則適用於本次研究的所有哺乳類目。由於在相關分析中沒有針對系統發育進行矯正，所以作者對超過10個物種的每一目進行了單獨的統計:偶蹄目:R = 0.41, P = 0.008 (n = 40);食肉目:R = 0.33, P = 0.019 (n = 51);靈長類:R = 0.39, P = 0.007 (n = 52);翼手目:R = 0.69, P = 0.00001 (n = 31);齧齒目:R = 0.64, P = 0.0001 (n = 29)。這說明，對於每個一個目種而言，這種相關都是穩定的。
爲了測量連接成本，作者量化了總連接長度(即所有纖維長度的總和)。在所有哺乳動物中使用了標準化長度，每個體素相對於大腦體積都有相同的大小（具體見方法部分，作者對所有動物的大腦體素進行了針對其全腦體積的標準化，保證所有動物的體素數目是相同的）。需要注意的是，由於纖維束追蹤實際上並沒有測量軸突，而是測量軸突束和神經束，因此，對長度的估計反映了宏觀網絡的連接長度。有趣的是，所有哺乳動物的標準化連接長度並不取決於大腦的大小(圖1f)。
除了上述發現，本文還發現，一個物種的大腦半球之間的連接也會有所不同，並且，連通性守恆原則也適用於物種內的差異。對來自四種不同物種(人類、獼猴、果蝠和老鼠)的多個個體的檢查顯示，大腦半球間連接較少的個體，其大腦半球內連接較好（圖2）。這說明，本次的研究結果也適用於物種內的個體差異，由於本次研究中個體之間的掃描信噪比(SNR)和分辨率非常相似，這表明研究結果中所描述的現象不是該方法造成的僞影，該結果應該是魯棒的。
圖2 物種內的個體半球內MSP與連合纖維的連合比例的相關
註釋：在獼猴(a)、人類(b)、蝙蝠(c)和老鼠(d)中，半球內MSP作爲連合比例的函數。兩個有代表性的連接體以網絡連接圖的形式呈現，顯示了全部200個節點的連接。兩個連接體分別顯示低的半球內MSP(底部)和高的半球內MSP(頂部)，左半球連接爲紅色，右半球連接爲藍色。大腦半球之間的連接用綠色表示。節點是根據他們的大腦解剖位置(補充數據圖1)。(獼猴、人類、果蝠和大鼠的皮爾遜相關效應大小;R2 = 0.31, n = 11;R2 = 0.57, n = 22;R2 = 0.22, n = 5;R2 = 0.44, n = 7)。
爲了研究連合纖維較少的大腦如何改善半球內連接，作者還計算了每個大腦中強連接的比例，即權重超過比例中值的連接。大腦半球連接較好的大腦有更強的連接，這表明權重更強的連接是半球內連接的主要貢獻者(圖3a)。仔細觀察強連接的網絡，發現後前縱束是所有物種中最強大的連接。因此，作者在48個物種中對其進行了重構，發現其權重與MSP呈顯著負相關，表明其有助於改善連通性(圖3b;R2 = 0.39, P <10 -5, Pearson’ s相關檢驗，n = 48)。
圖3 強連接驅動半球內的連接
註釋：a圖，半球MSP與強連接網絡密度呈負相關(P <10 -61 ,Pearson s相關，R2 = 0.71, n = 232)。爲了揭示特定的強連接的結構特徵，作者生成了一個熱圖，顯示所有的強連接投射到一個正中矢狀切片上(擴展數據圖2)。四個葉的估計標誌被顯示出來，以供比較。這張熱圖表明，無論大腦體積或MSP如何，後前縱向纖維束(擴展數據圖2中爲淺紅色)是哺乳動物中最強的連接。在48種物種中，前後縱束權重與半球MSP顯著相關(其穿過的區域用彩色編碼(P <10 -5;Pearson’ s檢驗，R2= 0.49, n = 48)。
拓展數據圖2：強連接 在正中矢狀位顯示的所有的強連接的連接圖
補充圖14 哺乳類動物的後前縱向纖維束的圖示化
研究結論：
該研究揭示了一個守恆原則，在哺乳動物中，網絡連接和標準化的連接成本幾乎獨立於網絡架構（即不同的物種存在不同連接模式，有些物種連合纖維較少）而固定。使用相對標準的(而不是絕對的)連接成本進行比較是合理的，因爲大型動物可以在連接成本上會投入更多的能量。研究結果發現，這一保護原則適用於所有哺乳動物，並與大腦大小無關，表明一種選擇性的進化壓力有利於有效的連通性和連接成本的平衡。本觀察進一步支持了這一結論，即守恆原則不僅適用於連接體的種間變異，而且也適用於連接體的種內變異。DTI有幾個衆所周知的侷限性，但本研究的許多對照驗證表明，這些侷限性並不影響本文的發現和結論。
100多年前，大腦連接研究的先驅拉蒙·卡哈爾（Ramon y Cajal）提出假設，認爲大腦應該節約連接成本和提升傳導速度。通過大量的比較，本文能夠證實這些假設。本研究收集的數據庫有望揭示哺乳動物連接的更多基本原理，其中一些可能轉化爲認知和其他功能。偏離這些原則的物種和個體可能意味着臨牀問題或獨特的認知功能。這方面的研究應該在未來獲得更大的關注，可能會產生許多新的見解。
原文：Conservation of brain connectivity and wiring across the mammalian class
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